GUS活性的组织化学检测.docVIP

GUS染色液的配制 GUS染色液的配制主要参照Jefferson（1987）的方法。 (1) 配制50mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）：A液：称取NaH2PO4.2H2O 3.12g 溶于无菌蒸馏水，定容至100ml。B液：称取Na2HPO4.12H2O 7.7g 溶于溶于无菌蒸馏水，定容至100ml。取39ml A液与61ml B液混合。 (2) 配制X-Gluc(5-bromo-4chloro-3indolylglucuronide)母液：称5mg X-Gluc，溶于1mlDMF(二甲基甲酰胺)。 (3) 染色液配制：磷酸钠缓冲液50 mmol/L（pH7.0），0.1%TritonX-100, 亚铁氰化钾5mmol/L，高铁氰化钾5mmol/L,X-Gluc 0.5mg/ml。 GUS活性的组织化学检测 GUS活性的组织化学检测主要参照Jefferson（1987）的方法。 (1) 愈伤组织瞬间表达及稳定转化的GUS检测 愈伤组织瞬间表达的GUS检测：用带有重组质粒pOsMT2bL-GUS和35S-GUS的农杆菌EHA105感染水稻愈伤，共培养3d后，从每皿中各取10颗愈伤，用蒸馏水清洗除去愈伤表面附着的农杆菌。滤纸吸干水分。同时用未作任何处理的愈伤作阴性对照，将这些愈伤分别浸没在染色液中，37℃保温3-20h。肉眼或显微镜下观察，愈伤上的蓝色小点即为GUS表达位点。 愈伤组织稳定转化的GUS检测：取经两轮抗性筛选后pOsMT2bL-GUS和35S-GUS转基因抗性愈伤，同时用未作任何处理的愈伤作阴性对照，将这些愈伤分别浸没在染色液中，37℃保温3-20h。肉眼或显微镜下观察，愈伤上的蓝色小点即为GUS表达位点。 (2) 根、茎、叶中的GUS检测 剪取pOsMT2bL-GUS和35S-GUS转基因水稻及未转基因水稻成熟植株的根、茎、叶、叶鞘、叶舌叶耳结合部（其中根、茎、叶鞘用解剖刀横切），浸没在染色液中，37℃保温3-20h，转入70%乙醇中脱色2-3次，至阴性对照材料呈白色。肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为GUS表达位点。 (3) 花器官中的GUS检测 剪取pOsMT2bL-GUS和35S-GUS转基因水稻及未转基因水稻成熟植株的幼穗、开花前1d和开花后2d的颖壳、花（花需要在解剖镜下将雄蕊和子房分离出来），浸没在染色液中，37℃保温3-20h，转入70%乙醇中脱色2-3次，至阴性对照材料呈白色。肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为GUS表达位点。 (4) 种子中的GUS检测 剪取pOsMT2bL-GUS和35S-GUS转基因水稻及未转基因水稻的成熟种子，剥壳后在蒸馏水中浸泡2d至萌芽，浸没在染色液中，37℃保温3-20h，肉眼或显微镜下观察，种子上的蓝色小点即为GUS表达位点。