屎肠球菌LS170308株抑菌特性及其安全性评价.pdfVIP

摘 要 屎肠球菌是一种常见的肠道正常菌，一般认为屎肠球菌毒力较弱，且其可以抑制 病原菌繁殖，促进营养物质消化吸收等作用，常将其制备成微生态制剂广泛应用于养 殖业，但屎肠球菌作为益生菌使用时具有明显的菌株差异性，因此针对益生菌筛选需 要进行大量工作。本研究从动物源粪便中分离出一株具有抑制病原菌生长的屎肠球菌， 对其抑菌效果进行评价，同时通过基因组学等手段对该菌株进行安全性评价，给予该 菌株生产应用提供理论支撑。 1. 屎肠球菌选择培养基配方筛选 由于市场上未出现屎肠球菌选择培养基，仅包含肠球菌选择培养基、粪肠球菌选 择培养基、屎肠球菌显色鉴别培养基，通过以上方法不能轻松获得目的菌株屎肠球菌。 故本研究通过对屎肠球菌培养特性进行探讨，选用胆盐、叠氮化钠、盐酸头孢吡肟对 非肠球菌属细菌进行筛除，通过调节培养温度筛选出屎肠球菌。研究采用单因素考察 及正交试验确定培养基配方，结果表明基础培养基添加0.04%叠氮化钠、1.5%胆盐、 250μg/mL 头孢吡肟及5%小牛血清，培养温度调整至50℃时，培养基上仅生长出屎 肠球菌，符合预期试验结果。该培养方法具有较好的筛选效果，操作简便，无需特殊 设备，且成本较低，具有一定的市场应用价值。 2. 屎肠球菌益生菌株筛选及其益生机制初探 本研究通过自制的选择培养基从林麝粪便样品中筛选出多株屎肠球菌，分别采用 触点式接种至不动杆菌固体培养基上，最后获得一株具有明显抑制不动杆菌生长的屎 肠球菌菌株，命名为屎肠球菌LS170308株，通过实验验证该菌株对大肠杆菌、不动 杆菌、耶尔森氏菌、假单胞菌、金黄色葡萄球菌等生长具有一定的抑制作用，在其培 养4~16h 时抑制作用最为明显，但该菌株对肺炎克雷伯氏菌生长抑制作用较差。进一 步研究发现屎肠球菌抑菌活性物质主要是培养上清中大于50kDa 的蛋白，通过二级 质谱对培养上清进行分析，预测该活性蛋白为sagA 肽聚糖水解酶。将蛋白进行表达 纯化后验证抑菌功能，证实sagA 肽聚糖水解酶具有抑制其他细菌生长的作用。实验 证实该菌株具有生产应用价值，可以有效抑制其它细菌生长的作用，但还需要对该菌 株进行体内抑菌验证。 3. 屎肠球菌菌株安全性评价 为确定该菌株应用安全性，研究从细菌致病性、耐药性对该菌株进行评价，通过 I 体外安全性及体内安全性综合考察，确定该菌株的应用安全性。研究采用全基因测序 手段测定该菌株所携带的毒力基因、耐药基因、产生物胺相关基因等；同时进行细菌 药敏实验及对小鼠、家兔致病性实验。实验结果证实该菌株携带有 efmA 、 AAC(6)-Ie-APH(2)-Ia、ErmA、dfrG、AAC(6)-Ii、lias、lnuB、ANT(6)-Ia、lsaE、ANT(9)-Ia、 cat、tetM、tet(L)、ErmB 等耐药基因，药敏试验也证实该菌株对阿莫西林、替卡西林、 头孢菌素、多西环素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、复方新诺明、诺氟沙星、甲 氧苄氨嘧啶完全耐药，值得注意的是该菌株对青霉素及链霉素存在一定程度敏感；对 环丙沙星、丁胺卡那、克林霉素、红霉素等抗生素中介；对氯霉素、氟苯尼考、呋喃 妥因抗生素敏感。基因组显示该菌株不携带有临床与屎肠球菌致病性有关的毒力基因 Cyl、gelE、asal、efaA、Hylefm，通过动物实验验证该菌株致病力极弱，在接种菌液 11 浓度达到2.38×10 CFU/mL 时，仍不导致动物发生疾病且病理学诊断证实未穿过机体 细胞屏障，但该菌株会代谢产生酪胺，因此对该菌株安全性仍需进一步验证。 本研究从动物粪便样品中成功分离出一株具有明显抑制其它细菌生长的屎肠球 菌，该菌株具有潜在的生产应用价值，对该菌进行安全性评价发现该菌株致病力极弱， 但该菌株染色体及质粒上携带多种耐药基因，且具有类似耐药基因岛结构，表明该菌 株耐药基因可能会在种间进行传播，但仍需要相关实验研究证实其耐药基因传播性。 同时该菌株尚未进行体内抑菌验证，需要相关实验进一步证实其生产应用价值。 关键词：屎肠球菌；选择培养基；抑菌活性；sagA 肽聚糖水解酶；安全性评价 II Abstract Enterococcus faecium