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PCR 产物的胶回收分离纯化 一、实验仪器 1、琼脂糖凝胶电泳系统 2 、紫外观察分析仪 3、离心机 4 、单面刀片 5、恒温水浴锅 二、试剂 1、 DNA 回收试剂盒 2 、50×TAE 3、ddH2O 三、步骤 1 在紫外灯下切分含 DNA 的琼脂糖块，尽可能除去多余的 琼脂糖．放入 1.5ml 离心管中。 4. 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以 1 mg=1 μl 进行计算。 5. 向胶块中加入胶块融化液 DR-I Buffer ，DR-I Buffer 的加量如下 表： 凝胶浓度 DR-I Buffer 使用量 1.0 ％ 3 个凝胶体积量 1.0 ％～1.5％ 4 个凝胶体积量 1.5 ％～2.0 ％ 5 个凝胶体积量 6. 均匀混合后 75℃加热融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶只需在 45℃加热）。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约 6～10 分 钟）。注）胶块一定要充分融化，否则将会严重影响 DNA 的 回收 率。 7. 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer 量的 1/2 体积量的 DR-II Buffer ，均匀混合。当分离小于 400 bp 的 DNA 片段时，应在此溶 液中再加入终浓度为 20% 的异丙醇。 8. 将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。 9. 将上述操作 7 的溶液转移至 Spin Column 中，12,000 rpm 离 1 分钟，弃滤液。 注）如将滤液再加入 Spin Column 中离心一次，可以 提高 DNA 的回收率。 10. 将 500 μl 的漂洗液Rinse A 加入 Spin Column 中，12,000 rpm 离 30 秒钟，弃滤液。 11. 将 700 μl 的 Rinse B 加入 Spin Column 中，12,000 rpm 离 30 秒钟，弃滤液。注）请确认 Rinse B 中已经加入了指定体积的 100% 乙醇。 12. 重复操作步骤 11 。 13. 将 Spin Column 安置于新的 1.5 ml 的离心管上，在 Spin Column 膜的中央处加入 25 μl 的灭菌蒸馏水或 Elution Buffer ，室温 静置 1 分钟。注）把灭菌蒸馏水或 Elution Buffer 加热至 60℃使用 时有利于提高洗脱效率。 14. 12,000 rpm 离 1 分钟洗脱 DNA 。将 1.5ml 离心管(DNA)贮 存于-20℃ 。 15 琼脂糖凝胶电泳检测回收产物。 制备 ：溶胶液：6 M NaClO 4 (pH 5.2) ，0.03M NaAC(pH 5.2)溴酚红少许 洗液：50 mM Tris-cl，0.1 mM EDTA ，pH 8.0) 70% 乙醇 存储液：TE buffer (10 mM Tris-cl ，0.1 mM EDTA ， pH 8.0). 注意事项 1. 电泳的buffer 和 gel 都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌， 总之一句话就是保证切下的带没有外源 dna 污染。 2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积，可以 用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。 3. 关于