《免疫组织化学染色技术》.pptVIP

第四节 双重免疫组织化学染色 应用免疫组织化学染色方法在同一张组织切片或细胞涂片上同时或先后显示两种抗原成分，即为双重免疫标记。光镜下通过标记物或其反应生成物的颜色来标记不同的抗原成分，以帮助研究者了解含有这些不同抗原的各类细胞、组织之间的相互关系。 可能遇到的问题是：后一种免疫染色所用的抗体系统可能与前一种染色所用的抗体系统发生交叉反应，从而造成叠加污染，失去双重染色的准确性和意义。为避免这种交叉反应，研究者建立了一些方法，按其作用原理和方式，可分为洗脱法和非洗脱法。 一、洗脱法 1. 基本原理： 可选用同种动物产生的特异性抗体（如兔抗X和兔抗Y IgG 抗体）为一抗，另一种动物相应的抗体（如生物素标记的羊抗兔IgG抗体）为二抗，用ABC、SP或SABC方法，或应用EnVison方法进行染色，用不同的酶和底物系统呈色。在完成第一种免疫组化染色后，将抗原抗体复合物洗脱，再做第二种染色。 2. 洗脱液： （1）甘氨酸-盐酸溶液(pH 2.2)：0.1 mol/L盐酸+0.757%（0.1mol/L）甘氨酸溶液95ml（0.1mol/L的氯化钠溶液配制）。用该溶液洗切片2h，一般能够消除第一种染色的抗体系统与下一种染色的交叉反应，但保留显色反应所得的颜色。 （2）高锰酸钾-硫酸洗脱液：1 ml 2.5% KMnO4，1ml 5% H2S04，加140ml蒸馏水混匀。 3. 洗脱法的一般步骤 ? 按常规做第一种免疫组化染色，可选用HRP为标记物，显色底物为4-氯萘酚，阳性部位反应产物为蓝色。 ? 开始第二种染色前，先将切片经蒸馏水洗，再用酸性溶液洗脱。如用pH 2.2的甘氨酸-盐酸溶液须浸洗2h左右，如用高锰酸钾-硫酸洗脱液则要5min左右，再将切片移入0.5%的焦亚硫酸钠（Na2S2O5）水溶液中还原30s，经水洗10-20min，蒸馏水洗5min， ? 按常规进行下一种免疫组化染色。第二种染色选用DAB为显色底物，生成物呈棕褐色，与第一种染色中生成的蓝色可形成比较鲜明的对比。 二、非洗脱法 （一）直接法 如果采用不同种酶标记在不同的第一抗体上，则只能用顺序染色法。即先做第一种染色，用第一种底物与已定位的酶反应呈色，再进行第二种染色。 （二）标记双抗原法 两种一抗分别来自不同种动物，二抗分别来自另外两种不同动物，且标记两种酶分别作为标记物做双重染色时，一般第一种染色选用HRP，而在第二种染色中可按需要选择不同的酶。如选用ALP，还可用不同的底物呈现不同的颜色，如坚固蓝呈现的蓝色可与DAB的棕色形成良好的对比，坚固红虽然与DAB的棕色对比相对较差，但也可选用。 （三）活性灭活法 是一种新建立的方法，主要是根据通过在溶液中加热灭活第一次染色中的抗原、抗体和酶活性后再进行第二种染色的原理而设计的。用于灭活的溶液介质一般是柠檬酸缓冲液（pH 6.0），灭活的温度一般是96℃左右。本法的优点是用于染色的一抗、二抗可分别来自于同一种动物，方便了抗体的选择，只是选用不同的显色酶和底物。但缺点是所要显示的第二种抗原必须耐热。 免疫荧光染色及多重染色技术Single and multiple immunofluorescent labeling ◆原理：是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗体或抗原标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。 ◆方法：直接法、间接法。 检测方法 一、直接法 用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异性荧光抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下可见抗原存在部位呈现的特异性荧光。此法特异和简便，但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。 二、间接法 是直接法的重要改进，先用特异性第一抗体抗体与细胞标本反应，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用标记荧光的第二抗体与结合在抗原上的抗体结合，形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，从而提高了敏感性，与直接法相比荧光亮度可增强3～4倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，适用于多种抗原的标记显示，是目前最广泛应用的技术。 间接法染色原理 标记不同荧光发色剂的商品化二抗： 1. Alexa Fluor ? 555，显示红色荧光； 吸收光谱峰值：555nm ，激发光谱峰值：565nm 。 2. Alex