检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术.pdf

in vivo ：在体内 in vitro ：在体外 一、检测蛋白质与蛋白质相互作用 ① FRET 技术（in vivo） FRET ，Fluorescence resonance energy transfer，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧 光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示： 以下图为例，若要利用 FRET 检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合， 并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对 CFP 进行激发，并检测 GFP 是否放出绿色荧光。如果能检测到绿色荧 光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。 ② 酵母双、三杂交技术（in vivo） 酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如 GAL4、GCN4 等都含有二 个不同的结构域，即 AD 和 BD。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个 含有 AD 基因（假设为 A 载体），另一个含有 BD 基因（假设为 B 载体）。 一般将一个已知蛋白的基因连在 B 载体上，作为诱饵(Bait)，将未知蛋白的基因连在A 载体上，将这两个载体都转到特定的 酵母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵 母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法 在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示： in vivo ：在体内 in vitro ：在体外 由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂 交系统。该系统的原理如下图所示： 如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段，即 C 端段(Cub)和 N 端段(NubG)，并在 C 端段的 N 端接上一个 LexA-VP16 录因子，此时它并不能激活基因转录（因为它被限制在了 C 端段上，不能进入细胞核发挥作用）。 将该 C 端段连到一个膜蛋白上，将 N 端段连接到另一个膜蛋白上。若两个膜蛋白有相互作用，那么两个膜蛋白在相互靠 近时会使泛素蛋白的 N 端段和 C 端段靠近结合，形成一个完整的泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记的片段降 解，那么连接 C 端段的 LexA-VP16 转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达。 酵母三杂交的原理与双杂交一样，只是它研究的是两个蛋白和第三个成分间的相互作用，通过第三个成分使两个蛋白相 互靠近。第三个成分可以是：蛋白、RNA 或小分子，如下图所示： 如上图所示，在加入第三种成分前，蛋白 X 与蛋白 Y 之间并无直接相互作用，因此无法使 BD 和 AD 靠近，报告基因不能 表达；当加入第三种成分后，蛋白 X 与蛋白 Y 的距离被拉近，BD 和 AD 靠近，报告基因表达，从而可以被检测到。 ③ Pulldown 技术（in vitro） Pulldown ，即蛋白沉降技术，它是建立在蛋白质亲和层析的基础上的一种检测蛋白质间相互作用的分析方法。亲和层析的 原理如下图所示，不同蛋白对配体的亲和程度不同，因此可以先将非特异结合的蛋白用低浓度缓冲液给清洗出去，只剩目的蛋 白与层析柱结合，然后再用洗脱液将目的蛋白洗脱下来，达到纯化目的蛋白的作用。 in vivo ：在体内 in vitro ：在体外 Pulldown 技术利用的是亲和层析技术以及特异的配体（如 GSH 或者镍）。以下图为例，将 GST 的基因与蛋白X 的基因融 合，表达出融合蛋白。将该融合蛋白的溶液过带有 GSH 配体的层析柱，那么这一融合蛋白就能结合在配体上，然后将待测蛋白 的溶液过柱，并让其与融合蛋白反应一段时间。 接着开始进行洗脱。如果待测蛋白与蛋白 X 无相互作用，那么在开始清洗的时候就会被洗下来；如果在用洗脱液洗脱后才 能在收集到的样品中发现待测蛋白（以及蛋白 X ），说明待测蛋白与蛋白X 可能有相互作用。 ④ Far western blot （in vitro） Far western blot 是基于 western blot 发展而来，其原理如下图所示。将样品蛋白用非变性的 PAGE 胶分离