《基因组文库构建》.pptVIP

四.假阳性克隆的克服 应用混合探针分离克隆基因虽取得了良好的效果，但也会产生相当数量的假阳性。克服假阳性的方法有二: (1)制备“ 猜测体(guessmer)” 探针 猜测体 探针是根据特定物种某已知蛋白的密码子使用频率，选择含有密码子简并程度最低的蛋白质区段进行人工合成的低简并性寡核苷酸探针。 猜测体探针只要有85％的 碱基能和目的基因配对即可杂交。如连续的配对区较长(达10～12Nt),那么猜测体探针作用的强度足以鉴定出含目的基因的阳性克隆。 如错配的核苷酸均匀分散在探针分子的各部位，那么这种猜测体探针就不会和目的基因的序列杂交。 提高杂交温度，以减少假阳性。 (2)PCR猜测体技术 ①测定尿酸氧化酶末端一段32aa的序列； ②根据此段顺序两侧的序列推测,合成一组引物； ③从猪肝中提取mRNA,反转录成cDNA,用以上 述引物对此cDNA进行特异扩增。 ④扩增产物连接到载体上进行克隆，并用唯一猜 测体探针进行杂交，选择阳性克隆。此猜测体 探针是按32aa序列推导猜测而来的。 ⑤分离的克隆中部为上述32aa,两端为引物序列。 ⑥用这段插入序列为探针，在严格条件下筛选 噬菌体cDNA文库。 五.应用差别杂交或 扣除杂交法分离克隆的目的基因 (一)差别杂交(diffential hybridization) 1.差别杂交要拥有两种细胞群体：在一个细胞群体中目的基因正常表达，而另细胞群体中目的基因不表达。 2.制备两种不同的mRNA提取物。一种含一定比例目的基因mRNA的总mRNA;另一种不含目的基因mRNA的总mRNA; 3.通过这两种总mRNA为探针的平行杂交对目的基因cDNA克隆文库进行筛选。 (二)扣除杂交 差减杂交的缺点： (1) 灵敏度低 (2)重复性差 (3)需用大量的杂交膜，工作量大，费时， 费钱 故可用扣除杂交来筛选，扣除杂交也可用来分析缺失突变基因 (三).用差别显示分离克隆的目的基因 DDRT－PCR (四)用免疫的方法分离克隆的目的基因 1.用靶蛋白制备抗体 2.用这种抗体制备抗抗体，一扩大信号。 3.标记抗抗体； 4.进行免疫实验。 六.筛选YAC文库 从理论上只要分离到大量的基因组克隆，并构建它们的限制图就可鉴别出重叠的基因组克隆，进而构建出全基因组的物理图。 实际上是很困难的。 (1)重叠的片段多，重叠的长度不均衡；(2)工作量大； 一个标准的YAC文库插入片段的总和相当于5～8个基因组大小，则需约500个96孔板和相应数量的杂交膜。因此，一般采Locus- specfic PCR来筛选。用“ 集”(pool)为单位(相当于4块96孔板)或用“ 超级集”(相当与20块96孔板)逐轮筛选，逐步缩小筛选范围。 七.基因定位克隆 基因定位克隆 (map-based cloning)是用于分离未知结构的目的基因。 从理论上说，任何已鉴别的突变基因都可用这种方法分离出来。 条件是： (1)已建立含此基因的YAC文库； (2)要有与目的基因紧密连锁的标记(已知基因或分子标记)。 (一).染色体体步移法(chromosome walking) (1)方法： 在人类和其它动物的定位克隆可用染色体体步移法：用邻近的标记为探针，在基因组文库中筛选重叠克隆。直到目的基因被克隆出。 (2)步移的方向和进度可通过中期染色体原位分子杂交来确定。 (3)大范围染色体步移有困难，因存在重复顺序而不能进行分子杂交。 (4)此可通过染色体跳跃(chromosome jumping) 来克服。 (二)染色体跳跃和跳查文库 跳查文库(jumping library) 这种文库的特点是每一克隆中含有原先相距很远的2个DNA片段。跳查文库是分离基因或特定DNA序列的有效筛查方法。 (三)连锁文库(linking library) 为了使筛查朝一个方向进行下去，要建立连锁文库。使钓出的片段和上一个片段相邻接。 跳查探针 连锁探针 基因组文库构建 cDNA文库(cDNA library) ： 克隆的重 组cDNA的总和，通常是在细菌或酵母中。 这些克隆代表从某个特定物种或器官的所 有mRNA制备得到的cDNA。 cDNA分子克隆(cDNA clone) ：将 cDNA片段装在载体上转化细菌,扩增出多 克隆的过程，最终可建立cDNA文库。 建库的目的： 1.从复杂