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WB 技术服务报告模板 正式实验 客户姓名： 报告日期： 一、客户样品及抗体登记 1．样品种属来源： 2．样品标记： 组织 细胞 样品名称 备注 3．抗体名称： 抗体来源： 抗体 Cat. 及 lot 号： 二、材料和方法 1．试剂及耗材 蛋白抽提试剂（改进型 RIPA 配方） BCA 蛋白定量试剂盒 2mg/ml BSA 标准品 5×还原样品缓冲液 10×Tris-Glycine-SDS 电泳缓冲液 考马斯亮蓝染色液 10×TBST pH8.0 中分子量蛋白  marker（7 条带） 中分子量预染蛋白  marker（7  条带） 湿转缓冲液 NC  膜， 0.45um 孔径  Millipore 丽春红染色液 BSA  Amresco PMSF  Amresco 蛋白酶抑制剂  Roche 磷酸酶抑制剂  Roche 脱脂奶粉  伊利 ECL  Millipore Stripping buffer（抗体洗脱液） （抗体需要选择，选择后把余外的删除） 山羊抗兔 IgG（H+L ），HRP 山羊抗小鼠 IgG （H+L ），HRP 兔抗山羊 IgG（H+L ），HRP  Jackson Jackson Jackson Beta-actin  兔多抗 Beta-actin  鼠单抗 Beta-tubulin  兔多抗 Beta-tubulin  鼠单抗 GAPDH  兔多抗 GAPDH  鼠单抗 2．实验仪器 Fresco低温冷冻离心机 MultiSkan3 酶标仪 Mini P-4 电泳槽 湿转电泳槽 电泳仪 半干槽  Thermo Thermo Cavoy Cavoy Bio-Rad Bio-Rad 水平脱色摇床  其林贝尔 酸度计 pH211  Hanna 电动组织匀浆器  Fluka 三、 实验方法及结果 3.1 蛋白抽提 3.1.1 组织蛋白抽提 预冷 RIPA 蛋白抽提试剂， 加入蛋白酶抑制剂 （磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑制剂）。在蛋白抽提开始前加入 0.1M PMSF 母液， PMSF 终浓 1mM 。称取组织重量以重量：裂解液体积 =1:9 比例加入裂解液，用眼科剪剪碎组织块， Fluka 电动组织匀浆器 15000rpm 转速进行匀浆，每次 10s，间隔 10s，进行三次匀浆。匀浆时 EP 管需要浸入冰水混合物中进行降温。 匀浆完成后在冰上孵育 20min，4 度离心， 13000rpm，20min。离心完成后取上清，分装储存，待测。 3.1.2 细胞蛋白抽提 预冷 RIPA 蛋白抽提试剂， 加入蛋白酶抑制剂 （磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑制剂）。在蛋白抽提开始前加入 0.1M PMSF 母液， PMSF 终浓 1mM 。细胞计数，以细胞数量 1×107 加入 1ml 裂解液，用枪头吹打充分悬起细胞，完成后在冰上孵育 20min，4 度离心， 13000rpm，20min。离心完成后取上清，分装储存，待测。 3.2 BCA 法蛋白定量 预备 BCA 工作液 A 液：B 液 =50:1，稀释好各个提取 BSA 标准品。样品用 PBS 进行稀释。 样品：BCA 工作液 =1:8，混匀后 37 度孵育 30min 或者室温孵育 60min，酶标仪 570nm 波长滤光片读取 OD 值。 蛋白浓度运算见下表： 3.3 蛋白浓度调整 以 RIPA 调整蛋白浓度，加入 5×还原样品缓冲液后样品终浓度为 2-4 mg/ml（不同样品具体确定） 。煮沸变性 5min。 样品蛋白浓度调整见下表： 3.4 SDS 3.4.1 按照目的蛋白的分子量，配制 12%分离胶，浓缩胶浓度为 5%。 3.4.2 待检测蛋白样品上样量：上样 20ug 3.4.3 电泳条件：浓缩胶恒压 90V，约 20min，溴酚蓝进行分离胶界面； 分离胶恒压 160V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部。 3.4.4 用考马斯亮蓝染色液进行染色。 染色结果见下图： 3.5 目的蛋白 WB 正式实验 3.5.1 按照目的蛋白的分子量，配制 %分离胶，浓缩胶浓度为 5%。 3.5.2 待检测蛋白样品上样量： 3.5.3 电泳条件：浓缩胶恒压 90V，约 20min；分离胶恒压 160V，通 过预染蛋白 marker 来确定电泳停止时刻。 3.5.4 湿转法，转膜条件： 300mA 恒流； 0.45um 孔径 NC 膜，转膜时 h。转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，观看转膜成效。 同时做好泳道标记，预备预实验时进行按照纵向泳道剪膜。 3.5.5 封闭：将膜完全浸没 5%脱脂奶粉 -TBST 中室温轻摇 60min。 3.5.6 一抗孵育：用 5%脱脂奶粉 -TBST 稀释稀释一抗，室温孵育 10m in，放