汇总狂犬病毒基础知识及生产工艺.ppt

地鼠的挑拣 清洗：纯化水4~6遍，注射用水3遍 消毒：2%甲醛溶液2遍，0.1%新洁尔灭2遍 解剖：扒皮、剪肌、取肾 洗肾： 消化：0.1%胰蛋白酶每对肾加入3~4ml，置2~8℃消化15~18小时。 解剖消化工艺 .新. * 地鼠消毒 .新. * 解剖地鼠 .新. * 培养液配制：Hanks’ 液＋营养液＋小牛血清＋硫酸庆大霉素 细胞制备：弃去消化液，洗涤肾块，摇振分散细胞，反复收集数次。 细胞培养：37±1℃培养90-100小时 细胞制备工艺 .新. * 细胞培养 .新. * 地鼠肾细胞 .新. * 细胞观察 毒种配制 接种 培养吸附： 34±1℃ 培养吸附18-24小时 接种病毒工艺 .新. * 维持液配制：199＋0.2~0.4%人血白蛋白＋碳酸氢钠 洗涤细胞 换维持液 病毒培养： 34±1℃ 培养96～120小时 洗换工艺 .新. * 细胞观察 收获病毒液：收获标准 加液：加维持液 取样检定 保存：收获液置2~8℃保存、待检；细胞瓶置34±1℃ 继续培养96～120小时 多次收获病毒液、加液工艺 .新. * 收获液检查 无菌转入 加灭活剂：终浓度甲醛溶液250μg/ml 灭活过程：灭活罐内混匀，于34℃±1℃恒温灭活18～20小时 取样检定 病毒灭活工艺 .新. * 采用截留分子量为300KD的滤膜超滤浓缩至蛋白质含量在2000～3000μg/ml范围内（浓缩倍数为50±10倍） 按照病毒收获液体积的0.3～0.6倍的灭菌PBS对浓缩液进行分段洗滤 超滤浓缩工艺 .新. * 浓缩液离心 层析介质为琼脂糖凝胶Sepharose 4FF 纯化：以pH 7.5的PBS洗脱，洗脱液流速240～280ml/分钟，280nm紫外检测,收集第一峰。 取样检定 纯化工艺 .新. * 配方计算：抗原含量≥4.5IU/ml，蛋白质含量应不高于80μg/ml 配制：将纯化后原液及终浓度为1%的人血白蛋白、40μg /ml的硫柳汞 转入合并罐内混匀。 取样 配制工艺 .新. * 最新最全 最新最全 最新最全 最新最全 最新最全 最新最全 最新最全 最新最全 最新最全 最新最全 最新最全 最新最全 最新最全 最新最全 狂犬病毒基础知识及疫苗生产工艺 2016年04月 .新. * 目录 .新. * 　狂犬病病毒归属于弹状病毒科(Rhabdoviridae），病毒形态是一端平坦或略凹状，另 一端为半原形，酷似子弹，故得名弹状病毒，病毒大小75*175nm经组织培养后，病毒的形态多呈两端平坦状的颗粒。单链RNA病毒.? 狂犬病毒的特点 .新. * 狂犬病毒形状 .新. * 狂犬病病毒电镜照片 .新. * 狂犬病毒对外界的抵抗力很弱，对温度敏感，60 ℃30~60min，100℃ 2min即可灭活。病毒对阳光、紫外线敏感，各 种常见的消毒剂如肥皂水、碘酒、3%来苏尔、75%酒精等均可使其灭活。 抗生素对其却无灭活作用。? 狂犬病毒的特点 .新. * 狂犬病病毒最大的特点是对神经组织的嗜性远远大于其他组织。在神经组织内病毒复制的比率远比在其他组织内高。 狂犬病毒的特点 .新. * 1、狂犬病毒形状为子弹形，一端为椭圆形，另一端平整。 2、狂犬病毒具有嗜神经性，主要在中枢神经内繁殖。 3、狂犬病毒最初进入伤口时，不进入血液循环，而是在被咬伤的肌肉组织中复制，然后侵入神经系统。 4、狂犬病毒在神经轴中的移动速度约5~100mm/天，如一定范围内（10um-2cm）的轴突同时受感染，病毒移行速度甚至会更快。 狂犬病毒的特点 .新. * ??　　? 野生动物与家畜是狂犬病的传染源。人类狂犬病由狗、猫直接传染者占90%以上，其次为牛（主要是水牛）、猪、兔、马、驴骡以及野生动物。?? 狂犬病毒的宿主动物 .新. * 通过神经进入分泌腺体： 在唾液中排出病毒 进入大脑细胞引起全脑炎 在神经系统中向心性移动 通过肌肉周围神经末梢进入神经系统 病毒在伤口周围肌肉细胞中复制 被动物咬伤而感染病毒 狂犬病致病机理 .新. * 一般 20 – 60 天 从暴露后数天到数年，差别非常大 主要的影响因素 感染的病毒数量 感染的病毒株 暴露的严重程度 暴露的部位 一般20 - 60天 1月内发病71% 3月内发病87% 7-10 天 10-20 天 21-28 天 1-3 月 3-6 月 6-12 月 1 年 3.25% 41.87% 25.88% 16.12% 3.25% 3.25% 6.38% 潜伏期 .新. * 人用狂犬病疫苗发展史 .新. * 1882年，巴斯德成功在牛脑中分离到狂犬病毒株，并在兔脑内连续传90代，成为固定毒。 1885年，巴斯德尝试研制减毒活疫苗 1911年，Sempl