《蛋白质的空间结构》.ppt

2．蛋白质的纯化方法 最常用的是二氧化碳，在78.3Mpa压力下，CO2处于液体状态，温度为31.1°C，当压力或温度发生改变时，CO2处于气－液中间态，具有溶剂性能，可以使许多蛋白质及有机物质溶解在某一状态。经过泵出、升温等步骤即可分离出来。 （3）萃取法 ?超临界流体萃取法 2．蛋白质的纯化方法 （3）萃取法 ?超临界流体萃取法 2．蛋白质的纯化方法 此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。 离子交换树脂可以分为阳离子交换树脂（如羧甲基纤维素等），阴离子交换树脂（如二乙基氨基乙基纤维素等）。 带正电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而带正电荷少的蛋白质与树脂结合则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，通过Na+的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。 （4）层析法 ?离子交换层析法 2．蛋白质的纯化方法 （4）层析法 ?离子交换层析法 2．蛋白质的纯化方法 此法又称为分子筛层析、分子排阻层析。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。 Sephadex-葡聚糖凝胶G10-G200 Sepharose-琼脂糖凝胶2B,4B,6B Sephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶S100,S200,S300,S400 （4）层析法 ?凝胶过滤法 2．蛋白质的纯化方法 （4）层析法 ?凝胶过滤法 2．蛋白质的纯化方法 利用蛋白质表面存在的疏水区域的强度、大小不同，而被吸附到连接有疏水基团的层析介质上。 离子强度增大可增强吸附能力，因此常常在2mol/L或3mol/LNaCl溶解样品，洗脱时可通过降低盐浓度、增加乙二醇浓度进行梯度洗脱。 正丁基-Sepharose、 正辛基-Sepharose 苯基-Sepharose （4）层析法 ?疏水层析 2．蛋白质的纯化方法 这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。 选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接。 将这种连接有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。 （4）层析法 亲和层析法 2．蛋白质的纯化方法 常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋白、酶的底物和抑制剂等。 层析柱载体为琼脂糖凝胶等。 （4）层析法 亲和层析法 2．蛋白质的纯化方法 在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。 蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动，从而达到分离各种蛋白质。 在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（v）取决于电场强度(E)，所带的净电荷(q)以及与介质的摩擦系数(f)。 （5） 电泳法 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦等。 2．蛋白质的纯化方法 SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约1 ? 2比例结合。 这样，每一个蛋白质分子都因为结合了许多的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。由于所有的蛋白质颗粒都带有大量的负电荷，而且它们的电荷密度也大体相同，因此，E?q值接近一个常数。所以该法主要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白质。 用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。 （5） 电泳法 ?SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 2．蛋白质的纯化方法 将两性电解质(pH3-9,或其它范围的如pH5-7)同蛋白质样品一起加入到已经铺好的凝胶上，在电场下，两性电解质首先达到它的等电点而平衡，蛋白质样品根据它自身的等电点分别向两极移动，最后也达到平衡。 （5） 电泳法 ?等电聚焦 3.蛋白质含量的测定 ?定氮法：灵敏度较低 ?双羧脲法：样品量0.2-1.7mg/L ?Folin-Lowry法：在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反应，生成蓝色化合物，将其与双羧脲法结合起来，蛋白质形成两种颜色的混合物老绿色，在650nm具有特定的吸收。灵敏度较高25?g-250?g/ml. ?考马斯亮蓝法（Bradford法）考马斯亮蓝G250是一种带有负电荷的染料，在酸性条件下，可与蛋白质上的正电荷结合，形成蓝色化合物，在595nm具有特定吸收，反应简便、快速、灵敏度高，5-50 ?g/ml. ?紫外吸收法 由于核酸在260nm具有光吸收，对测定干扰较大，可采用280nm、260nm同测法。 蛋白质浓度mg/