《重组子的筛选与鉴定》.pptVIP

* * 使抗原抗体反应在固相表面进行，洗涤法洗去未结合的反应物，以保证结果的特异性。 * * 表达蛋白只要其抗原决定簇存在，即可产生正常抗原抗体反应，但不代表抗原的组成与目标产物完全一致。 * * 影印比较麻烦，易造成菌落混淆。具体做法：将待测的浓缩菌悬液涂在合适的平板上，等其长好后作为母平板（每平板上的菌落控制在50～300个）；用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，构成印章（即接种工具）；然后把长有菌落的母平板倒置在丝绒的印章上，轻轻印一下；再把此印章在另一含有选择培养基的平板上轻轻印一下，经培养后，选择培养基平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置对应，比较影印平板与母平板上菌落生长情况，即可从相应位置的母平板上选出重组菌菌落。用此法可把母平板上10%-20%量的细菌转移到丝绒布上，并可利用这一“印章”接种8个子培养皿。 * * 也可先涂含氨苄的板，挑出转化子转到IPTG/ X－gal板上筛选重组子 * * * * * * * * * * * * 溶原化使细菌生长速度减慢。 * * * * * * * * * * 利用营养缺陷互补基因筛选的弊端：对选择培养基要求高 * * 酿酒酵母HF7c：亮氨酸、色氨酸和组氨酸营养缺陷型的酵母基因突变菌株 pPIC9为巴氏酵母表达载体， 宿主菌为GS115菌株 * * GS115和KM71存在一定的低频率自发回变，即重新变为HIS正常菌株，致使h/s4’平板筛选阳性重组子存在假阳性情况。 Invitrogen公司构建了多种P.Pastoris表达载体，如上。均为带HIS的载体 * * 卡那霉素抗性基因可用于筛选高拷贝转化子。机制：转化子的拷贝数与抗G418的能力有关,通过筛选抗G418能力强的酵母即可获得高拷贝转化子。 含0.5－1.0mmol/LCuSO4的培养基上可有效筛选含CUP1基因的自主复制型质粒pJDB207的转化子 基糖苷类药物修饰酶 ：磷酸转移酶(O-phospotransferases, APH)。 * 用于不期望带入抗生素抗性基因且营养缺陷筛选又不敏感酵母细胞筛选、 * * * 基因无义突变结果有两种，其中密码子改变为UAG的无义突变又叫琥珀突变，密码子改变成UAA的无义突变又叫赭石突变。 * * * * gpt选择系统可作为显性选择系统应用于各类受体细胞（哺乳动物细胞无gpt基因）。 体内嘌呤核苷酸的合成有两条途径：①利用磷酸核糖、氨基酸、一碳单位及CO2等简单物质为原料合成嘌呤核苷酸的过程,称为从头合成途径(denovo synthesis)，是体内的主要合成途径。②利用体内游离嘌呤或嘌呤核苷，经简单反应过程生成嘌呤核苷酸的过程，称重新利用(或补救合成)途径(saluage pathway)。在部分组织如脑、骨髓中只能通过此途径合成核苷酸。 * * 正常途经：从头合成途径 替代途径：中途合成途径 * * 普通哺乳动物细胞不含XGPRT同源物，可用于各种细胞的正性选择。 * * * * 胸腺核苷激酶基因表达——所有真核细胞 * * * * 正常途经：从头合成途径 替代途径：中途合成途径 * * 应用前提条件：拥有与目的基因某一区域同源的核酸探针 探针最好100－1000个碱基 * * 应用举例：插入失活双抗生素筛选法中因印迹比较麻烦、容易出错，就可先通过阳性选择先筛选转化子，然后用这种方法筛选重组子。 * * 判断插入方向：对于平末端连接，若酶切位点横跨载体和目标DNA，则连接方向不对时则酶切不动。 * * 设计与插入片段两侧及插入片段3′端部分序列互补引物PCR，则可根据结果既筛选重组子，且可保证筛出的重组子中目的基因与载体连接方向正确。 * * SDS－PAGE使蛋白变性，变性蛋白可能使某些抗原决定簇消失。 * * 一般用125I标记。除了标记二抗，还可标记A蛋白。A蛋白是金黄色葡萄球菌细胞壁的一种蛋白质，可与各种动物的IgG恒定区结合。 胸苷合成中的主要抑制剂 fluorouracil（五氟脲嘧啶） methotrexate（氨甲蝶呤或甲氨蝶呤 ） aminopterin（氨基喋呤） 二、哺乳动物细胞常用报告基因 β-半乳糖苷酶基因 绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein，GFP） 荧光素酶基因（luciferase，Luc） 三、哺乳动物细胞其他选择标记基因 1、二氢叶酸还原酶基因：dfhr 2、胸苷激酶基因：tk 二氢叶酸还原酶基因（dfhr）选择系统 二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）可将二氢叶酸还原成四氢叶酸，后者提供核苷从头合成的甲基。 Dfhr -的突变