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土壤酶活性测定方法 …… 王强锋 土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、 真菌和高等植物里。 它是一种酰胺酶作用是极为专性的， 它仅能水 解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机 物质含量、 全氮和速效磷含量呈正相关。 根际土壤脲酶活性较高， 中性土壤脲酶活性大于碱 性土壤。 人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基 质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定 未水解的尿素量来求得。本方法以尿素 为基质，根据酶促产物氨与苯酚 — 次氯酸钠作用生成 蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2） 10%尿素：称取 10g 尿素，用水溶至 100ml 。 3）柠檬酸盐缓冲液（ PH6.7 ）： 184g 柠檬酸和 147.5g 氢氧化钾（ KOH ）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用 1mol/LNaOH 将 PH 调至 6.7 ，用水稀释定容至 1000ml 。4 ）苯酚钠溶液（ 1.35mol/L ）：62.5g 苯酚溶于少量乙 醇，加 2ml 甲醇和 18.5ml 丙酮，用乙醇稀释至 100ml （A 液），存于冰箱中； 27gNaOH 溶 于 100ml 水（ B 液）。将 A 、B 溶液 保存在冰箱中。使用前将 A 液、 B 液各 20ml 混合，用 蒸馏水稀释至 100ml 。5 ）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为 0.9% ，溶液 稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取 0.4717g 硫酸铵溶于水并稀释至 1000ml ，得到 1ml 含 有 0.1mg 氮的标准液；再将此液稀释 10 倍（吸取 10ml 标准液定容至 100ml ）制成氮的工 作液（ 0.01mg/ml ） 。 三、操作步骤 称取 5g 土样于 50ml 三角瓶中，加 1ml 甲苯，振荡均匀， 15min 后加 10ml10% 尿素溶液和 20ml PH 6.7 柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在 37℃恒温箱培养 24 小时。培养结束后过滤，过 滤后取 1ml 滤液加入 50ml 容量瓶中，再加 4ml 苯酚钠溶液和 3ml 次氯酸钠溶液，随加随摇 匀。20min 后显色，定容。 1h 内在分光光度计与 578nm 波长处比色。 （靛酚的蓝色在 1h 内 保持稳定）。标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取 0 、1、3、5 、7、9 、11、13ml 氮工作液，移于 50ml 容量瓶中，然后补加蒸馏水至 20ml 。再加入 4ml 苯酚钠溶液和 3ml 次氯酸钠 溶液，随加随摇匀。 20min 后显色，定容。 1h 内在分光光度计上于 578nm 波长 处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。注意事项 : 1、每 一个样品应该做一个无基质对照， 以等体积的蒸馏水代替基质， 其他操作与样品 实验相同， 以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2 、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其 他操作与样品实验相同， 以检验试剂纯 度和基质自身分解。 3、如果样品吸光值超过标曲的 最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。四、结果计算：以 24 小时后 1g 土壤中 NH 3 －N 的毫克数表示土壤脲酶活性 （