分子标记技术的种类.pptxVIP

分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA 分子标记技术大致可分为三类: 第一类以 Southern 杂交为核心, 其代表性 技术为 RFLP；第二类以 PCR 技术为核心，如 RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP 等；第三类以 DNA 序列(mRNA 或单 核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为 EST 标记、SNP 标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共 显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开 发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具 有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1 限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism， RFLP） 1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了 差异，由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内 切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA 酶切片段，通过凝胶电泳将 DNA片段按各自的长度分开，通过Southern印迹法，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜 或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出限制 性片段长度多态性。进行 RFLP时，酶切要彻底，注意内切酶的选择，对于亲缘关系很近的物种，可增加内切酶的使用种类。 目前RFLP的使用领域很广泛，其具有以下优点：①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，理论上可覆盖整个基因组，能提供 丰富的遗传信息；②标记不受组织、环境和发育阶段的影响；③呈共显性，即杂交时等位DNA片段均呈现带，能区分纯合基因 型和杂合基因型，F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3]，提供标记座位完全的遗传信息；④由于限制性内切酶的专一性使结果 稳定可靠，重复性好。其缺点是：①操作繁琐，费时；②酶切后的DNA质量要求高；③使??放射性同位素进行分子杂交，有危 险性等。 2 随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA， RAPD) 20世纪80年代，基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道 DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷 酸单链(8-10bp)为引物，以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点， 一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产 物的数量和大小发生改变，表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应 区域DNA的多态性。与RFLP相比，RAPD方便易行，DNA用量少，设备要求简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先进行 序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构；合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片 段，并且不需使用同位素，安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低，易产生错配，故实验的稳定性和重复性差，且为显 性标记，不能区分纯合子和杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感，这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经 典的PCR可克服此限制，即设计更长的引物。1993年，Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region，SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序，设计一对互补;于原来RAPD片段两端序列的24聚体的引物，扩增原来模板DNA，产生SCAR-DNA片段。相对于 RAPD，SCAR由于使用更长的 引物和更高的退火温度而具有更高的可靠性和可重复性，对反应条件不敏感，且可以将显性RAPD标记转变为共显性的SCAR标 记，从而提高遗传作图效率。此外，还有任意引物PCR标记(Arbitary primer，AP-PCR)技术和 DNA扩增指纹(DNA Amplified fingerprinting，DAF）技术，前者使用20或3