PD在逆转EGFR-TKIs获得性耐药中的作用研究.ppt

Take Home Message Rb-E2F信号通路参与EGFR-TKIs获得性耐药的发生； 针对此信号通路的抑制剂如PD与TKIs联合可能逆转耐药； ACKNOWLEGEMENT 周清华教授 刘红雨教授 王玉丽 李颖 王珉 李永文 刘明辉 天津市肺癌研究所其他人员 天津医科大学总医院肺部肿瘤外科全体 国家自然科学基金吴阶平医学基金会 天津市自然基金  Thank You! PD0332991在逆转EGFR-TKIs获得性耐药中的作用研究 陈 军 天津市肺癌研究所 天津医科大学总医院肺部肿瘤外科 研究背景 表皮生长因子受体（EGFR）是目前最为主要肺癌分子靶向治疗的靶点。 EGFR-TKIs的耐药分原发性和获得性两类； 获得性耐药的40-60％主要是由于EGFR基因的二次突变 (T790M)和c-Met基因的扩增所引起； 此外，旁路信号通路的激活，激酶的转换（Kinase Switch）机理：如ERk，IGF－1R，PDGFR等高表达； 本研究将主要集中在这40-50%无EGFR的二次突变（如T790M）和c-Met基因的扩增相关的获得性耐药机制上。 研究材料 EGFR野生型细胞株：A549，H460等，对TKI为原发性耐药； EGFR敏感突变细胞株：PC-9， HCC827等，对TKI高度敏感； 从EGFR敏感突变细胞株建立的获得性耐药细胞株：PC-9/AB2，PC-9/AB11和PC-9/BB4等（本实验用） EGFR基因二次突变监测和分析（PCR+测序) 细胞培养、筛选稳定的耐药株 全基因组基因芯片分析 microRNA芯片分析 蛋白组学分析（2D+质谱） EGFR突变基因的逆转实验 EGFR基因突变与吉非替尼治疗患者临床疗效分析 阳性基因和蛋白的验证、鉴定 （Real-Time PCR、Western blot） 评价靶基因在吉非替尼获得性耐药中的作用，探讨耐药机理，寻找新的治疗靶点并指导临床治疗 阳性靶基因的表达情况与吉非替尼治疗患者临床特征分析（ Real-Time PCR、免疫组化） 靶基因的逆转实验 应用基因转染和siRNA干扰技术，对已确定的在敏感株和耐药细胞株之间的差异的阳性靶基因进行干预。 细胞周期（FACS） 增殖（MTT） 凋亡 (FACS、TUNEL) 不同细胞株间生物学特性的研究 研究设计 初步结果 一、 PC-9及其子系耐药株 药物敏感度差异的研究 Cells inhibition ratios with Iressa Typan Blue staining Counting MTT Assay Cell lines IC50（μmol/L） RI PC-9 0.0067±0.0034 1 PC-9/AB2 1.56±0.285 233±42 PC-9/AB11 2.78±0.099 415±14 PC-9/BB4 1.75±0.082 261±12 P 0.00 0.00 IC50 for PC9 and its derived cell lines by MTT assay 二、不同细胞株中EGFR 基因突变和基因扩增检测和分析 初步结果 Sequencing result for the mutation of EGFR exons 18-21 in PC9 cells Exon18 Exon19 Exon20 Exon21 PC9 Wild type 15bp deletion Wild type Wild type PC9/AB2 Wild type 15bp deletion Wild type Wild type PC9/AB11 Wild type 15bp deletion CAA→CAG Wild type PC9/BB4 Wild type 15bp deletion Wild type Wild type PC-9 PC-9/G PC9-AB2 PC9-BB4 PC9-AB11 不同耐药细胞株中不存在EGFR的二次突变和c-Met基因扩增 不同耐药细胞株中MET基因蛋白的表达无明显差异 三、 从基因表达角度探讨获得性 耐药的产生机制：全基因组芯片 分析 初步结果 54675 probe sets on the Human genome U133 plus 2 microarray PC-9 vs PC-9/AB2 PC-9 vs PC-9/BB4 PC-9 vs PC-9/AB11 Signal ratio Signal ratio Signal ratio 2249 up-regulated genes 725 down-regulated genes 1364 up-regulated