抗多肽制备流程及原理.ppt

抗多肽制备流程及原理 1118 ESses  抗原多肽的设计 2.抗原多肽的偶联策略 3.多肽合成简介 4.抗多肽血清的制备 5.血清的检测  1.抗原多肽的设计 为产生有效的抗体,第一步是设计好的抗原 此抗原可以来源于整个蛋白质的一部分:一金 抗原决定簇区域的序列 (1)什么是抗原决定簇? 蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区 域叫抗原决定簇。一般抗原决定簇是由6-12氨基 酸或碳水基团组成,它可以是由连续序列(蛋白质 级结构)组成或由不连续的蛋白质感 维结构组成。  Discontinuous Epitope Continu。u Epitope (2)选择抗原决定簇 为选择好的抗原决定簇,应符合以下三版 1.亲水性( /drophilicity)):部分抗原决定簇亲水性 的; 2.表面可接触性( Surface Accessibility)):大部分抗体只 与蛋白质表面部分结合; 3.有弹性(eity):许多知的抗原决定簇是在自由 活动区域 所以一般来说蛋白质的N端及C端是很好的抗原决 定簇区域。  3)抗原性与免疫原性 单独的抗原决定簇是不能产生免疫反应,它只有 抗原性但没有免疫原性,为使它能具有免疫原性, 必须偶联在载体蛋白上。 (4)抗原决定簇的预测 对每个氨基酸的表面可接触性、亲水性和弹性进 行计算可以大体推算出抗原决定簇区域,抗原决定簇 区域应综合以上三个特点。目前市面上有几个专业测 定软件满足需要:如 MacVestor, Protean,GCG等。 备注  (5)设计多肽序列的长度 抗原性区域确定以后,接下来要确定多肽的长度 关于选定多肽长度有两种不同的观点。一种观点认为 长的多肽(20-40个氨基酸)比较好,因为长的多 无疑会增加抗原基的数量。另一种观点则认为小的多 肽更有效,使用小的多肽能保障所产生抗体的位点特 异性。但有一点是明确的,不管长度如何,所选多肽 必须能够较容易地通过生化合成得到,并且能溶解到 水溶性缓冲剂进行载体蛋白的耦联。由于受副反应的 影响较大,高于二十个氨基酸的多肽通常很难进行高 纯度合成,并且常常会含有缺失性序 xoipj-cn  另一方面,太短的多肽(10个氨基酸)则会产生 识别特异性很强的抗体,以至于无法识别整体蛋白, 或亲和性很低。因此综合考虑制备性抗原地多肽有效 长度一般是10-20个氨基。这种长度的多肽序列会最 大程度的减小生化合成困难,具有一定的水溶性,也 会具有一定程度的二级结构 (6)设计合成多肽 旦抗原序列决定后,接下来就是设计所需合成 的多肽了,设计时除了注意其序列外,同时应考虑 些产生免疫机制问题,如: 1:’载体蛋白的接入位置。  2.如果其序列是位于蛋白C端的,此多肽G端 定是自由的羧基团,而N端被掩盖。同时如果载体 蛋白是通过半胱氨酸偶联,此半胱氨酸应处手N端 位置,使C端完仝暴露给免疫系统 3.相反,如果其序列是位于蛋白质N端此多肽 C端应掩盖,暴露出N端,而载体蛋白应在C端。 NH CoNH N亠 erni nHl cNH Interna I Hat-Cws r-errrinTI V  2.抗原多肽的耦联策略 化学合成的多肽抗原是小分子,本身很难具有 好的抗原性,只能诱导动物产生很弱的免疫反应 因而与载体蛋白耦联是很重要的。载体蛋白含有很 多抗原决定基,能够刺激T细胞,进而诱导B细胞 反应。用于与多肽耦联的载体蛋白有多种,其中最 常用的是( keyhole limpet hemacyanin(KLH),牛血 清白蛋白( bovine serum albumin,BSA),卵清蛋白 ( ovalbumin,OVA)和牛甲状腺球蛋白( bovine thyroglobulin,THY)。KLH具有更高的抗原性,是 最为常用的多肽耦联载体。BSA也常用来作为多肽 载体,但由于BSA经常被用做检测试验的阻断剂而 使得该方法生产的抗体在应上存在着一定的局限 性  设计合成性多肽常常被忽略的一个方面是如何将 多肽耦联到载体蛋白上。例如,N-端序列需要通过 C-端氨基酸耦联,而C-端序列则需要通过№-端氨基 酸耦联。内部序列则可以耦联到仼何一端。内部序列 耦联的另一考量则是将非共轭端酰基化或氨基化,因 为原蛋白分子序列中不会含有带电荷的未端。最常用 的耦联方法都是基于自由氨基(alph-氨基或Lys)、 sulfhydryl(Cys)或羧基集团(Asp,G|u,或 alpha-羧基) 的存在。所有的耦联方法都应该是通过羧基或氨基端 残基将多肽耦联到载体蛋白上。所