Caspase3活性荧光检测试剂盒.doc

Caspase-3活性荧光检测试剂盒 Caspase（天胱蛋白酶）家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作 用，其中 Caspase-3是凋亡信号通路中一个重要的蛋白酶，也是凋亡的关键执行 分子。 Caspase-3正常以酶原（ 32KD）的形式存在于胞浆中，没有活性。在凋亡 的早期阶段，它被激活；活化的 Caspase-3由两个大亚基（ 17KD）和两个小亚基 12KD）组成，裂解相应的胞浆、胞核底物，最终导致细胞凋亡。但处于晚期凋亡以及死亡的细胞中 Caspase-3的活性明显下降，会影响 Caspase3活性检测结果，建议选择早期和中期凋亡的细胞进行检测。 .原理： 在凋亡早期阶段，活化的 Caspase-3能够特异地剪切 D1E2V3D4-X底物，水 D4-X 肽键。 根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽 Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，发光基团 AMC 不能被激发荧光，短肽 Ac-DEVD-AMC被水解后释放出发光基团 AMC，游离的 AMC 才能被激发发射荧光。根据释放的 AMC 荧光强度的大小，可以测定 Caspase-3的活性，从而反映 Caspase-3被活化的程度。 二 .方法： （一）细胞总蛋白提取和定量 : 选用适当方法诱导细胞凋亡，同时设阴性对照组。以下操作均在冰上或 4°C 进行，所有液体需事先预冷： 1..收获正常和凋亡细胞，用 PBS洗细胞 2 次，将其转入 EP管，离心并弃尽上清； 2.将细胞重悬于加入 Cocktail 的细胞裂解液中， 1X106 细胞约加 50 l 裂解液（视细胞多少而定加入裂解液的量），混匀后冰浴 分钟；（此步可加入细胞裂解液后超声裂解细胞）。 3.离心 12000rpm/10 分钟，收集上清，即为细胞总蛋白； 1 / 3 4.取少量上清（ 1－2μl），用 Bradford 或 BCA法进行蛋白质定量，检测前将蛋白用细胞裂解液（含 Cocktail）稀释为 2 g/ l。 （二）体外 Caspase-3的活性检测： 1.实验设空白对照孔和待测样品孔，均加入含荧光底物 Ac-DEVD-AMC的Caspase-3反应缓冲液（反应缓冲液使用前加入 Reagent 1和 2）45 l/ 孔； 2.空白孔加 5 l/ 孔正常细胞裂解液（含 Cocktail），待测样品孔加 10 g/孔 5 l）细胞总蛋白，总量 50 l/ 孔。 3.加入样品后立即使用 Polarstar 荧光分光光度计检测 AMC 释放量，分析荧光强度（激发光波长 380nm，发射光波长为 460nm），每 10 分钟测定一次，连续监测 120 分钟，检测条件温度 37oC。以荧光强度 “增加倍数 ”代表 Caspase-3酶活性，每个样品至少做三个重复孔。 三 .试剂盒内所含试剂组分： （ 50Tests）各管或瓶内实际量多于标记量 1、荧光底物（ 2.25 l） 2、蛋白酶抑制剂 Cocktail （50 l） 3、Reagent 1（25 l） 4、Reagent 2（25 l） 5、细胞裂解液 1 或 2（5ml ） 6、Caspase-3反应缓冲液（ 2.25ml）配方： 细胞裂解液 1：（试剂盒提供 Cocktail,临用前 1：100 加入细胞裂解液 1 中，例： 细胞裂解液 1,1ml 加入 Cocktail 10 l）。 细胞裂解液 2：（不含 cocktail）用户自己准备。 Caspase-3反应缓冲液： 2 / 3 （临用前 1:100 分别加入 Reagent 1,Reagent2,例： Caspase-3反应缓冲液 1ml 加入 Reagent1和 Reagent2 各 10 l；以此反应缓冲液稀释荧光底物）。 荧光底物： 50tests/管、 100tests/管两种规格（临用前 1：1000 加入 Caspase-3反应缓冲液 已加 Reagent1和 2与荧光底物混合，例： 荧光底物 2.25 l 加入反应缓冲液 2.25ml）。 四.注意事项： 1.若检测过程中各组间 Caspase-3活性差异不大，但 Caspase-3荧光强度仍 持续增强，可适当延长检测时间。 2.某些凋亡诱导剂引起的细胞凋亡可能存在非依赖于 Caspase-3活化机制，这种情况时，本试剂盒检测 Caspase-3活性无明显改变，需考虑凋亡机制中的其它信号通路。 3.储存条件： － 20oC，避光保存，避免反复冻融。 3 / 3