Nanopore测序仪精密性验证及应用.pdfVIP

摘 要 近些年，随着新一代测序技术的发展与普及，nanopore 测序技术逐渐进入人们 的视野，因其测序读长长、测序周期短、操作简单等优点，成为了众多研发工作人 员的意向对象，因此，开发出测序读长更长、测序周期更短、操作更为便利的 nanopore 测序仪，成为了 nanopore 测序仪开发者急需解决的问题，但在追求测序读长更长、 测序周期更短、操作更为简单等性能的前提下，如何保证 nanopore 测序仪的精密性 也成了急需解决的问题，本文旨在验证 nanopore 测序仪的精密性，以及制备不同物 种的 nanopore 测序文库，测试 nanopore 测序仪的应用性能，得到结果如下： 通过载体质粒酶切、测试文库片段人工合成，制备线性化的载体和测试文库片 段，线性化载体和测试文库片段通过一步克隆，制备双链测试文库片段制备质粒和 单链测试文库片段制备质粒。 以双链测试文库片段制备质粒为模板，经PCR 扩增，在双链测试文库片段两端 加上 BsaI 限制性内切酶位点及不同的粘性末端，PCR 产物经纯化、BsaI 限制性内切 酶消化及纯化，制备足量的双链测试文库待连接片段，设计测序接头，测序接头与 双链测试文库待连接片段连接，连接产物经胶回收，制备双链测试文库，为测序仪 精确性验证制备了实验材料。 将单链测试文库片段制备质粒转化至大肠杆菌 JM109 内，后者经过夜培养、分 离培养上清、目的M13 phage 单链基因组提取，获得含单链测试文库片段的目的 M13 phage 单链基因组，目的M13 phage 单链基因组与酶切互补片段退火，经 EcoRI 、XbaI 限制性内切酶消化、磁珠纯化，制备单链测试文库待退火片段，设计测序接头，测 序接头与单链测试文库待退火片段退火，制备单链测试文库，为测序仪精确性验证 制备了实验材料。 使用 nanopore 测序仪对已制备的双链测试文库、单链测试文库进行测序，比对 双链测试文库、单链测试文库的 nanopore 测序结果与双链测试文库、单链测试文库 的核酸序列信息，验证了 nanopore 测序仪对双链测试文库、单链测试文库测序的精 确性，结果表明：nanopore 测序仪对双链测试文库片段测序的准确率为 95.0% ， nanopore 测序仪对单链测试文库片段测序的准确率为 86.3%。 在验证 nanopore 测序仪的精密性基础上，使用 nanopore 测序仪分别对人、小鼠 的 SCFV-Fc 轻链基因进行测序分析，探究 nanopore 测序仪的实际应用价值，得到结 果如下： 人、小鼠的 SCFV-Fc 轻链基因 5 端经EcoRI 限制性内切酶消化、3 端经HindIII 限制性内切酶消化，纯化产物建库；比对人、小鼠的 SCFV-Fc 轻链基因酶切文库的 nanopore 测序结果与人、小鼠的 SCFV-Fc 轻链基因酶切文库的序列信息，得出 I nanopore 测序仪在实际应用上的精确性，nanopore 测序仪对人的 SCFV-Fc 轻链基因 酶切文库片段测序的准确率为 95.4%，nanopore 测序仪对小鼠的 SCFV-Fc 轻链基因 酶切文库片段测序的准确率为 95.6% ；综合上述实验结果，nanopore 测序还存在一定 的误差率，nanopore 测序仪还有待进一步改进提高。 关键词 nanopore 测序；测序读长；一步克隆法；突变引物；M13 噬菌体；SCFV-Fc II Abstract In recent years, with the development and popularization of next-generation sequencing technology, nanopore sequencing technology has gradually entered peoples field of vision. Because of its advanta