生物化学实验：第十次试验.docVIP

实验十一 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法分离血清蛋白 一．实验目的 1．掌握PAGE凝胶电泳的三个效应。 2．了解盘状电泳的特点及适用范围 二．实验原理 (一) 聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应： 1、浓缩效应。 2、电荷效应。 3、分子筛效应。 (二)本实验利用聚丙烯酰胺凝胶作电泳支持物。电荷数和分子大小不一的各种血清蛋白质通过浓缩效应、电荷效应、分子筛效应而被精细地分离。由于具有以上三种效应，所以此方法分离效果好，分辨率高，血清蛋白在纸上电泳仅能分成5～7个组分，而在聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳中可分出12～30个组分。 三．实验仪器 电泳仪 电泳槽 注射器 长针头 吸管 培养皿 四．实验试剂 三羟甲基氨基甲烷（简称Tris） 贮备液的配制：按下表配制A、B、C、D、E、F各贮备液，然后冷藏于4℃条件下，以防变质。 染色液： 0.05%氨基黑10B溶于7%醋酸溶液，或者用灵敏度高5倍考马斯亮蓝R250溶液染色。 脱色液：7%醋酸溶液。 电极缓冲液（pH8.3甘氨酸-Tris缓冲液）：甘氨酸28.8g，Tris0.6g加水定容至1000ml. 指示剂：0.01%溴酚蓝溶液。 五．实验步骤： 1.制胶 取一支长10cm左右的玻璃管，在一端套上乳胶管和短玻棒。 （1）7%聚丙烯酰胺凝胶（PH8.9，分离胶）(三组10ml) ： 将试剂按A:C:H2O:E=1：2：1：4比例混合于一烧杯中，用滴管将分离胶加入玻璃管至8cm高度，表面再加少量水覆盖，在日光灯下聚合20分钟左右，当有界面出现时，表明已经聚合，吸取分离胶表面的水分。 （2）2.5%聚丙烯酰胺凝胶（pH6.7，浓缩胶）(三组2ml) ： 将试剂按B:D:F:E=1：2：1：4比例混合于烧杯中，迅速将其用滴管加到分离胶上面。 至玻璃管9厘米处（即加入1厘米高），在小心地加入一层薄水。 然后胶管移至日光灯下放置20分钟左右，待第二次出现界面，表示聚合完成，除去表面水分。 序号 A B C D E F 1mol/L盐酸 Tris TEMED ACr Bis (NH4)2S2O3 蔗糖 加水并稀释至 PH 48ml 36.6g 0.23ml 100ml 8.9 48ml 5.98g 0.46ml 100ml 6.7 28g 0.735g 100ml 10g 2.5g 100ml 0.14g 100ml 40g 100ml 2.安装胶管 把玻璃管下端得橡皮冒除去（拔时用力不要过猛，以防使胶条受损），将胶管安装在电泳仪上。 注意垂直，并要紧密，防止缓冲液从上槽漏下。 然后分别在电泳槽的上下槽体内注入电泳缓冲液，下槽的液面应没过玻璃管的下管口（注意不要有气泡存在）和电极丝；上槽的液面应没过玻璃管口0.5 ~1cm。 3.加样 1ml新鲜血清, 用40%蔗糖溶液稀释10倍，加1ml0.1%溴酚蓝示踪剂混匀。 用微量注射器或移液枪向胶管内加5-10ul(20ul)样品液，注意微量注射器或移液枪头要插入胶管内加液, 注意不要让样品溢出管口 。 4.电泳 上槽连接负极，下槽连接正极，然后通电，先每管电流3mA电泳，当示踪剂进入分离胶时，电流增至每管5mA。 当示踪剂移至胶管下端1cm处时，关闭电源，取出胶管。电泳大约2-3小时。 5.剥胶 取一只带长针头的注射器，灌满水，将针头从浓缩胶的一端小心的管壁与凝胶之间，转动胶管，并同时推动注射器，在针头向前推动时，注入蒸馏水，使胶条随水的压力及润滑作用从玻璃管中脱离。 6.染色 将剥出的胶条于氨基黑10Ｂ染色液或染色灵敏度高５倍的考马斯亮蓝Ｒ溶液中染色10分钟 7.脱色 将胶条自染色液中取出后，用水冲去表面的染料，置于7%醋酸溶液中浸洗脱色，经常换新溶液，直至背景几乎无色为止，约需2-3天的时间 8.观察绘图 将脱色胶条取出放于滤纸上，观察分离色带，将结果绘于实验报告纸上。 六．试验流程及结果 漂洗一天后的结果 漂洗完成后的结果 七．实验注意事项及思考题 注意事项： 1.在电泳时所用凝胶试剂应选用高纯度试剂，否则会影响凝胶聚合和电泳效果。 2.样品中的盐浓度应尽量底，否则有拖尾现象。 3.最大加样量不超过100ug蛋白/100ul 。 4.丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时宜带手套和口罩。 5.若电泳时间长，可以考虑在电泳槽下放冰降温。 思考题 1、解释聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个效应？ 答：浓缩效应：在电泳开始阶段，由于不连续pH 梯度的作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。分子筛效应：聚丙烯酰胺凝胶是网状结构，会依据蛋白质的分子量的大小，蛋白质分子的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开 电荷效应：在浓缩胶中，被分离物的各组分被浓缩，特