细胞冻存与复苏.pptVIP

细胞复苏与冻存 暨 南 大 学 医 学 院 生物化学教研室 费 嘉 一、细胞冻存 在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内、外环境中的水都会形成冰晶，导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等，引起细胞死亡。 在培养液中加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。 目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）。 DMSO的常用浓度为5%-10%。 添加DMSO保护剂的细胞在液氮中冻存1-2年，存活率可达80%-90%。 DMSO液需预先用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。 试剂和器材 器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶，2 ml）、离心管、吸管、离心机等试剂：含保护剂的培养基（即冻存液） 操作步骤： 1、消化细胞，收集细胞悬液。2、离心，1000 rpm 10 min，弃上清液。3、沉淀加冻存液，计数，调整至5×106/ml左右。4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。5、封口6、标注 标明细胞种类、冻存日期。 7、梯度降温：室温→ 4℃（20分钟）→冰箱冷冻室（30分钟）→ 低温冰箱（－30℃ 1小时）→ 气态氮（30分钟）→ 液氮 注：本室降温程序：室温→ 4℃ 30分钟 →冰水中 10分钟 → －20℃ 30分钟 → －80℃ 过夜→ 液氮 ?注意事项： 1、冻存细胞的活力 95%以上 2、避免冻伤 3、避免液氮挥发干净 4、新复苏的细胞在72小时里最好不要更换培养基，或传代。 5、?新引进的细胞株，应首先做好冻存备用。 二、细胞复苏 复苏原则：速融 ----- 冻存细胞的复苏以急速融化为原则，使培养物能快速通过对细胞有损害的-5～0℃摄氏度区域，细胞仍能生长，活力受损不大。 操作步骤: 一、准备工作 1、 37℃水浴 2、准备一个内装5-10 ml 细胞完全培养基离心管，温度 = 25 ℃ 。 二、复苏 1、从液氮中取出冻存管、迅速置于37℃水浴中，1分钟。 2、打开冻存管，迅速将细胞悬液吸到离心管中，轻轻混匀。 3、1000rpm离心10 min，弃去上清液。 4、沉淀中加入适当培养基，37℃常规培养，第二天观察生长情况。 细胞复苏注意事项 防止冻存管在水浴中融化时爆炸 ---- 远离 ---- 勿拆除包装布袋，佩戴防护眼镜、口罩。 快速融化，并迅速去除冻存液。 五、细胞运输 1.长距离运输（几天） 2.短距离运输（几小时） 3.细胞悬液空运 4.液氮冻存运输 四、血清灭活 目的：去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生毒性作用 。 方法：56℃ 30 min 注意事项：血清溶解过程中必须规则地摇晃均匀，才不会使产品质量受损。 * 步骤： -20 ℃ 2-8℃部分溶解 室温下全部溶解 56℃水浴热灭活30 min 若液N2进入冻存管，融化时会发生爆炸。 快速融化，并迅速去除冻存液。----5 分钟内完成。 ，它是一种渗透性保护剂，对细胞无毒性，分子量小，溶解度好，能迅速透入细胞，降低冰点，提高细胞膜对水的通透性，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结之前透出细胞外，在胞外形成冰晶，提高细胞内的电解质浓度，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞冻伤