细胞周期细胞凋亡操作步骤.docVIP

细胞周期 取生长状态良好的细胞，用0.25%胰酶消化为单个细胞，用正常培养基重悬计数，接种于60mm的皿，每个皿大约接种细胞1X10^6个。37°C 5% CO2培养1-2天。 当细胞融合度大约80%，细胞处于对数增长期时，用0.25%胰酶消化为单个细胞，1100转离心3分钟。 去掉上清，DPBS洗1次，每次6mL，1100转离心3分钟。 去掉上清，0.5mL冰冷的DPBS重悬成单个细胞后，逐滴加入70%冰乙醇6mL，边加边晃动，4度冰箱过夜（乙醇固定作用比较慢，最好多放几天，最好一周内继续做下面的步骤）。 1800转离心5分钟，弃上清，用6mL DPBS清洗两次，1800转离心5分钟。 用0.5mL PBS重悬（如果细胞过多，可用更多PBS重悬，然后取0.5mL），加入2uL Rnase（100mg/mL），终浓度为（400mg/mL），室温作用30分钟。 加入10uL PI，避光孵育15分钟，可上流式细胞仪检测。 Annexin V- FITC/PI测细胞凋亡。 取生长状态良好的细胞，用0.25%胰酶消化为单个细胞，用正常培养基重悬计数，接种于6孔板，每个孔大约接种细胞5X10^5个。37°C 5% CO2培养1-2天。 当融合度大约80%，细胞处于对数增长期时，用0.25%胰酶消化为单个细胞，每个孔用一个15ml离心管单独收集，1000转离心3分钟。 用2ml DPBS重悬细胞， 1000转离心3分钟。 用2ml 1 X Banding Buffer重悬细胞， 并且计数，1000转离心3分钟。 用1 X Banding Buffer重悬细胞，使细胞密度为1X10^6个/ml。取100ul到一个新的流式管中。 选取正常的细胞三管为补偿管，①双阴性-正常细胞，不加入任何抗体。②Annexin V- FITC补偿管，加入Annexin V- FITC抗体5ul。③PI补偿管，加入PI抗体5ul。 样本管为处理过的细胞，对照组为正常细胞，分别加入 Annexin V- FITC抗体5ul和PI抗体5ul。避光室温15min。 加入400ul 1 X Binding Buffer。尽快上流式细胞仪检测。