抗肿瘤药物体内筛选试验统一标准操作作业规程SOP.doc

抗肿瘤药品体内筛选标准操作规程 概述： 抗肿瘤药品是指能够直接杀伤或抑制肿瘤细胞生长或增殖一类药品，作用机制包含抑制肿瘤细胞核酸或蛋白质合成、干扰大分子物质代谢、干扰微管系统、抑制拓扑异构酶等。 本操作规程包含和抗肿瘤药品申请临床试验和申请上市相关非临床有效性和安全性研究内容，其中着力强调非临床有效性和安全性之间关联性，和非临床研究和临床试验之间关联性。意在首先为抗肿瘤药品非临床研究提供技术参考；其次，经过技术要求引导科学有序研发过程，使中国这类药品研发更趋规范和合理。 本操作规程仅代表现在对抗肿瘤药品非临床研究通常性认识。具体药品非临床研究应在本指导标准基础上，依据药品本身特点制订研究方案。 研究目标： 建立一套包含抗肿瘤药品体内作用药效学研究和评价体系及对应标准操作规程和抗肿瘤药品安全性和作用新机制研究。 有效性研究 抗肿瘤药品有效性研究目标关键在于探索受试物作用机制、作用强度、抗瘤谱等，为以后安全性评价和临床试验中适应症、给药方案选择提参考信息。 安全性评价 安全性评价目标关键包含：（1）估算 I 期临床试验起始剂量；（2）估计药品毒性靶器官或靶组织；（3）估计药品毒性性质、程度和可逆性；（4）为临床试验方案制订提供参考。 研究计划： (a)小鼠急性毒性测试 ??? 根据急性毒性测试常规方法，选择昆明种小鼠，经过腹腔注射方法给药，测定体外抗肿瘤活性突出化合物半数致死量（LD50），参考给药小鼠体重改变情况，评价化合物急性毒性，并确定小鼠体内抗肿瘤活性测试给药剂量。(b)小鼠体内抗肿瘤活性测试??? 依据动物体内抗肿瘤活性测试标准方法，选择昆明种小鼠，皮下接种肉瘤S180或肺癌H22瘤株，选择体外活性突出且急性毒性较低化合物，设定适宜剂量经过腹腔注射方法给药，以临床常见抗肿瘤药品环磷酰胺作为阳性对照药品，测定肿瘤生长抑制作为体内活性评价指标。(c)专利保护范围内化合物继续合成???申请保护范围较大专利，合成部分可能含有良好活性新化合物，拓展研究范围，发觉活性更强化合物，并申请新发明专利。并可针对具体化合物申请隶属专利，延长高活性化合物保护期限。（d）体外抗肿瘤活性广泛筛选??? 采取MTT法或台盼蓝染色法，测定化合物对多个人肿瘤细胞株增殖抑制活性，确定化合物在不一样瘤株间抗肿瘤活性选择性，为裸鼠模型试验提供依据。（e）抗肿瘤作用机理深入研究??? 依据抗肿瘤（f）人癌裸鼠移植瘤模型试验活性化合物作用机理特征，选择微管蛋白聚合等试验从分子水平确定化合物作用机理；利用人脐静脉血管内皮细胞探讨化合物对内皮细胞骨架影响及诱导凋亡途经，从细胞水平上说明化合物作用机理。?? ?依据抗肿瘤新药审批措施要求，采取裸小鼠皮下接种模型和/或原位移植瘤模型，以相对肿瘤增值率和生存时间为指标，确定化合物抗肿瘤活性。（g）动物体内药品代谢动力学试验??? 选择在人癌裸鼠移植瘤模型试验中活性良好化合物，开展动物体内药品代谢动力学试验，考查化合物吸收、分布、代谢、排泄性质。（h）动物亚急性，长毒试验??? 依据抗肿瘤新药审批措施要求，测定动物亚急性、长毒性质，进行药品安全性评价。 基础方法： ①小白鼠灌胃法 以左手捉持小白鼠，使腹部朝上，右手持灌胃器。灌胃器先从小白鼠口角插入口腔内，然后沿着上颚壁轻轻插入食管，稍感有阻力时（大约灌胃管插入1/2，相当于食管过膈肌部位），即可推进注射器，进行灌胃（图1）。若注射器推进困难，应重插。若灌胃器误插入气管给药，可致小白鼠死亡。注药后轻轻抽出灌胃管。此法1次给药量为0.01-0.03ml/g。 图1.小白鼠捉持及其灌胃法 ②小白鼠皮下注射法 通常在其背部皮下注射。将其皮肤拉起，注射针刺入皮下，把针尖轻轻左右摆动，易摆动表示已刺入皮下，然后注射药液。拔针时，以手指捏住针刺部位，以预防药液外漏（图2）。该法对小白鼠1次注射药量为0.01-0.03ml/g。 图2.小白鼠皮下注射法 ③小白鼠静脉注射法 通常采取尾静脉注射法。事先将小白鼠或大白鼠置于固定筒内或铁丝罩内，或扣于烧杯内，使其尾巴露出（图3）。将尾置于45-50℃温水中浸泡或用75%酒精棉球擦之，以使血管扩张。然后，选择尾巴左、右两侧静脉进行注射。注射时若出现隆起白色皮丘，说明药品未注入血管。这时，注射器应向尾根部位移动，重新注射。该法对小白鼠1次注射量为0.005-0.01ml/g。 图3小白鼠尾静脉注射法 ④小白鼠腹腔注射法 以左手捉持小白鼠，让其腹部向上，右手将注射器针头刺入皮肤，刺入部位距离下腹部腹白线稍向左或右位置（图4）。向前推进注射器3-5mm,，接着使注射针和腹部皮肤面呈45°刺入小白鼠腹肌，继续向前刺入，针头经过腹肌进入腹腔后阻力消失，这时即可慢慢注入药液。对小白鼠1次注射量为0.01-0.02ml/