放射自显影基本原理与应用.ppt

放射自显影基本原理和应用 很久以来，人们就注意到了细胞细胞分裂现象并进行了大量研究。20世纪50年代初，Howard对32P-磷酸盐培养的RNA酶处理过的蚕豆尖细胞进行了研究，借助放射自显影技术，首次证明了被标记的细胞不是分裂细胞，而是间期细胞，表明DNA合成是在新时期完成的，并发现在开始标记8h才出现标记的分裂核，持续6h后开始减少。这种变化每30h出现一次，因此提出了细胞周期概念。 放射自显影基本原理和应用 20世纪50年代未Quastler和Sherman用3H-TdR和放射自显影技术进一步证明了DNA确实在间期合成的，在细胞周期活动中的确存在DNA合成期（S）和细胞分裂期（M）。在S和M期之间以及S期之前，各有一个间隔，分别称为DNA合成后期（G2）和DNA合成前期（G1），进而将细胞周期分为G1、S、G2、M四个时相。 放射自显影基本原理和应用 二、常有术语 1、时间参数： TG1：G1期持续时间 TG2：G2期持续时间 TS： S期持续时间 TM： M期持续时间 TC： 一个细胞周期持续时间 放射自显影基本原理和应用 2、指数： LI：标记指数（标记细胞在群体中所占比例） GF：生长指数（处于增殖状态细胞在群体中所占比例） MI：有丝分裂指数（有丝分裂细胞在群体中所占比例） 放射自显影基本原理和应用 三、原理 细胞动力学研究，最重要的是对细胞进行标记。胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA的特有前身物，处于S期细胞能摄取TdR合成DNA。将3H-TdR或14C-TdR放入实验培养体系中，它只能被S期细胞摄取，而不改变DNA分子的生物、化学特性。根据探测到的3H或14C量可以了解被标记细胞的增殖、分化和消亡规律。 放射自显影基本原理和应用 四、方法 （一）一次标记一次取样法 将3H-TdR加入细胞培养15—30min，洗涤后做放射自显影，计算标记细胞，并按公式计算标记指数（LI） LI=Ns/Nc Ns：标记细胞数；Nc：处于细胞周期中的总数 在一个稳定细胞群体中，细胞处于某时相的细胞数量与该时相的时间呈正比，故： LI=Ts/Tc 放射自显影基本原理和应用 （二）一次标记多次取样法 又称有丝分裂百分率法。即一次标记后，在一定时间内多次取样，用放射自显影或液闪测量，观察M期（有丝分裂期）细胞中标记细胞的比例，即有丝分裂标记百分比（PLM）。 PLM=标记M期细胞数/M期细胞总数 以PLM为纵坐标，时间为横坐标可得PLM曲线。 放射自显影基本原理和应用 TG2 TM Ts Tc Tc Ts TG1 + TG2 TG2 放射自显影基本原理和应用 （一）引入途径 1、体内实验：可由静脉、皮下、肌肉、腹腔或直接脑内注射和灌胃等途径引入放射性标记化合物。 2、体外实验：对组织、细胞、体液的培养过程，则可在培养瓶中引入。在离体标本上研究受体等生物活性物质，也常将示踪剂直接加在切片上进行结合反应，然后洗去多余的示踪剂后再进行自显影。 放射自显影基本原理和应用 二、放射自显影的标本制备 总要求：标本制备过程不能引起示踪剂的流失或移动。 （一）组织切片 （二）整体小动物或大动物脏器切片 （三）牙齿、骨骼 （四）体液、培养液中的细胞或其他成分 （五）电镜标本 （六）无细胞的标本 放射自显影基本原理和应用 （一）组织切片 1、冰冻切片：标本采集后不经固定，直接快速冷冻。冰冻的标本不能反复冻融，直接放置-80℃备用。然后进行切片，切片冷冻干燥后，移入室温后置4℃进行自显影。适用于扩散性示踪实验和需保存生物活性的实验。 2、石蜡切片：标本经固定液固定（福尔马林、多聚甲醛）固定、水洗、脱水、二甲苯浸透、石蜡包埋等过程，常温下切片。标本不宜用含重金属盐的固定液，防止干扰结果。固定后必须充分水洗，制备过程中示踪剂和某些组织成分可能发生扩散或流失，一般只用于非扩散性实验。 放射自显影基本原理和应用 （二）整体小动物或大动物脏器切片 实验动物引入示踪剂后，用药物麻醉动物，然后将动物投入干冰丙酮混合液或液氮中快速冷冻，以防组织内形成结晶，待全部冻结，用羟甲基纤维素包埋动物，包埋块在整体切片机上制成切片，再进行自显影操作。 放射自显影基本原理和应用 （三）牙齿、骨骼 观察无机成分时，可在磨石上制成磨片。先用10%福尔马林固定，经磨石加水研磨至表面平整的薄片或剖面，然后乙醇脱水、干燥，再进行自显影。观察有机成分时，可脱钙后制成石蜡切片。 放射自显影基