微生物限度检查法检验操作规程.docVIP

文件编号 OS-QC-814-00 微生物限度检查法检验操作规程 页码 PAGE 5 of 5 广东和本堂科技制药有限公司 微生物限度检查法检验操作规程 颁 发 部 门 质量保证部 编号 OS-QC-814-00 页数 1 of 5 制 定 人 审 核 人 批 准 人 生 效 日 期 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 分 发 部 门 质量保证部 目的：建立微生物限度检查的基本操作规程，为微生物检查人员提供正确的操作规程。 范围：适用于化验室的微生物限度检查。 职责：微生物检验员对本标准的实施负责。 规程： 定义：微生物限度检查法：系指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。 实验用具： 电热恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、过滤器、滤膜、剪刀、试管、刻度吸管、量筒、锥形瓶、培养皿、试管架、玻棒、吸耳球、温度计、药匙、75%酒精棉球、三用紫外分析仪、生化培养箱、真空泵。 培养基： 营养琼脂培养基、 营养肉汤培养基、虎红琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、4-甲基伞形酮葡萄糖苷酸（MUG）培养基 试液：甲基红试液、a-奈酚乙醇试液、40%氢氧化钾溶液、靛基质试液。 稀释剂：0.9%无菌生理盐水溶液。 灭菌与消毒 灭菌 干燥箱灭菌：过滤器、剪刀、量筒、锥形瓶、培养皿、玻棒、刻度吸管、 高压蒸汽灭菌锅灭菌：培养基、生理盐水、滤膜、 消毒：温度计、供试品的表面、容器、架盘天平表面、真空泵 前紫外灯30分钟，对工作区域进行照射灭菌，前10分钟将通风机启动，台面用 棉球抹干净。 进入微生物室一更，用酒精擦试双手，换上已预先灭菌好的工作服。 供试品液与其稀释级的制备 供试品液（1：10）制备：用灭菌过的试管在超净工作台上称取供试品，称后用灭菌过的平皿盖盖上，放置试管架上，然后清理台面。在试管中加入适量的无菌生理盐水制成供试品溶液。混匀，减压抽滤，用无菌的生理盐水冲洗滤膜3次，每次为50ml，取出滤膜，置于100ml无菌生理盐水中充分振摇，即得。 1：102稀释液的制备：取（1：10）稀释液10ml，加进90ml无菌生理盐水，混匀，即得。 1：103稀释液的制备：取1：102稀释液10ml，加进90ml无菌生理盐水，混匀，即得。 对照用菌液：控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验，对照菌株为大肠杆菌[CMCC（B）441022]。 取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内，培养18-20小时，取肉汤培养基物1ml，稀释至1：10-6 ，即得对照菌液（约50-100个）。 检查法： 除另有规定外，细菌的培养温度为30-35℃，霉菌的培养温度为25-28℃，控制菌的培养温度为35±1℃。 细菌、霉菌计数： 平皿菌落计数法 取均匀供试液，进一步稀释成1：102、1：103等适宜的稀释级。分别取连续三级10倍稀释的供试液各1ml，置直径约90mm的平皿中，再注入约45℃的培养基约15ml，混匀，等凝固后，倒置培养，每个稀释级应作2~3个平皿。 营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数。 菌数测定阴性对照试验 取供试验用的稀释剂各1ml，置4个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板，培养，检查，不得长菌。 细菌培养时间为48小时，分别在24小时及48小时点计菌落数，一般以48小时菌落数为准，霉菌培养时间为72小时，分别在48小时及72小时点计菌落数，一般以72小时菌落数为准。菌落如蔓延生长成片，不宜计数。 点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。 菌数报告规则：细菌宜选取平均菌落数在30-300之间的稀释级，霉菌宜选取平均菌落数在30-100之间的稀释级，作为报告菌数计算的依据。如只有1个稀释级菌落数在30-300（30-100）之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告，如同时有两个稀释级在30-300（30-100）之间时，按下式计算两级比值。 比值= 当比值≤2时，以两稀释级的均值报告，当比值＞2时以低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告，如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30-300（30-100）之间时，以后两个稀释级计算级间比值，如各稀释级的平均菌落数均不在30-300（30-100）之间，以最接近30或300的稀释级平均菌数乘以稀释倍数报告，如各稀释级平均菌落数均在300（100）以上，按最高稀释级菌落数乘以稀释倍数报告，如各稀释级平均菌落数均小于30时，一般按最低稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告，如当1：10（1：100）稀释级平均菌落数等于或大于原液（或1：10）时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。 培养基稀释法：取供试液（原液或1：10供试液）