制备感受态细胞的实验报告.pdfVIP

制备感受态细胞的实验报告 一、 实验目的 掌握制备化学感受态细胞和电转化感受态细胞的方法和步骤。 二、 实验原理 1.感受态细胞的概念 重组DNA 分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表 达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA 分子的转化。 在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于 供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态 有着很大的关系。 所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA 片段并实现其转化的一种生 理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP 2+ 可以使感受态水平提高一万倍，而Ca 也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在 对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有 效期6 个月）。 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA 或以其为载体构建的重组DNA 导入细菌体内， 使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基 本实验技术之一。 受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl 等化学试剂法）处理后，使细胞 2 膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA 分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA 分子通 过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 化学制备法： 大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl 法），该法最先是由Cohen 于1972 年发现的。其 2 原理是细菌处于0℃，CaCl 的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA 形成 2 抗DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收 1 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中， 重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。 2+ 6 7 Ca 处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×10~2×10 转化子/ug 质粒DNA，可以满足 2+ 2+ 2+ 一般的基因克隆试验。如在Ca 的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn 、Co ）、DMSO 或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000 倍。 化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因 此被广泛用于外源基因的转化。 物理制备法： 电转法 （原理待续除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱 9 10 导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA 进入细菌，转化率最高能达到 10 ~10 转化子 /ug 闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。 效价的计算公式： 三、 实验步骤 1. 菌种活化 菌种保存在—70 度的超低温冰箱 2. 前培养 将单菌落接种到 10ml 的培养液中，在恒温振荡器37°下过夜培养 3. 培养基的制备 200ml 液体培养基：加水150ml 于烧杯中，加2g 蛋白胨，1g 酵母粉，2gNacl 定容200ml 在 磁力搅拌器中搅拌 200ml 固体培养基：在液体的基础上，加琼脂3g 在把液体与固体放到高压灭菌锅里 121℃ 20minutes 第二天接种菌液4ml 到培养基中在恒温振荡箱中培养一夜 化学方法：（以大肠杆菌感受态制备为例） 1) 测培养液（振荡了一夜的）OD600 若0.6A(在0