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2006 年《分子生物学实验技术》实验内容 一、 RT-PCR （一）总 RNA的提取 实验安排： 每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。 操作步骤： TM （苯冰预冷的 900μlLS -Biotragents 液体样品加入 1.5ml Ep 管中，再加入 1、将 100μl 酚和异硫氰酸胍的混合物） 。 2、将样品剧烈混合后，在室温放置 5min。 3、加入 200μl 氯仿，颠倒 Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和 10s。 4、在 4℃条件下，以 10000×g 离心 15min。 5、将上层水相转移到一个新的 Ep 管中，加入等体积的异丙醇（ Isopropanol）并混匀，然后在 4℃放置至少 10min。 6、在 4℃条件下，以 10000×g 离心 15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。 7、用 1ml 75%乙醇洗涤 RNA 沉淀和管壁。 8、将 RNA 沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用 10μl 无 RNase污染的水 RNase- Free Water）将 RNA 溶解并于 -20℃保存。 注意事项： 1、所有的玻璃器皿均应在使用前于 180℃的高温下干烤 6hr 或更长时间。 2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用 0.1% DEPC 水浸泡过夜。 3、配制的溶液应尽可能用 0.1% DEPC，在 37℃处理 12hr 以上。然后用高压灭菌除去残留的 DEPC。不能高压灭菌的试剂， 应当用 DEPC 处理过的无菌双蒸水配制，然后经 0.22μm 滤膜过滤除菌。 4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。 （二）反转录 实验安排： 每人做一管。 反应体系（ 20μ l）：按下列顺序加样 l4 5× Buffer l6dNTPs μl1RNA 酶抑制剂 l1Oligo （ dT） μ随机引 反转录 AMV1 提取 RNA6 总体μ 20 1h 42 反应条件： ℃ 注意事项： 反应体系中，应先 1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后 加。如在一般的 PCR 、引物，最后加酶和模板。 dNTPsBuffer 加水、、 2、液体 应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。 3、加完所有试剂后，应 用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。 ℃，以防酶失活。 4、酶类试剂应放置在冰盒上取用，用完后立即放回 -20 PCR （三） 实验安排： 每人做一管。 ：按下列顺序加样μ l）反应体系（ 50 ddHO 32.7 μl 2510×PCR Buffer μl 4μldNTPs 2P1 μl 2μlP2 0.3Taq l 4cDNA template μl l50Total 反应程序： 预变性 94℃ 2min 30s 变性 94℃ 45s 退火 50℃ 1min 延伸 72℃ 30 cycles 10min ℃ 72 终延伸 PCR产物的检测： 琼脂糖凝胶电泳 TBE(10×)的配制： 1、电泳缓冲液 ，定溶 1000ml。，并加入称取 Tris-base 54g，硼酸 27.5g0.5M EDTA(pH8.0) 20ml 、1.5% 琼脂糖凝胶的配制： 2 加 100ml，×琼脂糖于三角瓶中，加入 10ml 10TBE 缓冲 液，并加水定容至称取 1.5g，摇匀后倒入插有梳子的电泳槽， 待其凝固后拔去梳 EB(10mg/ml) 热溶解后加入 5μ l 即可用于电泳。 3、电泳检测：混合，加入到琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样μ l 产物 5μl 与 Loading Buffer 1 取 PCR 电流进行电泳，约 100V DL2000 DNA Marker 作对照，以电压， 50mA 品孔旁加入 5 μ l 15min 后于紫外灯下观察结果。 注意事项： 、 EB 有致癌性，电泳操作需戴手套进行。 1 的试污染的手套随意拿其它无 EB、禁止将盛有 2EB 的器皿随意乱放，且不要戴有 EB 剂或仪器。 产物的纯化（四） PCR实验安排： Gel 产物合并后作为一管，用 PCR 产物 回收试剂盒（ E.Z.N.A. 每两人的 PCR DNA 。）回收目的 Extraction Kit 操作步骤：琼脂糖凝胶电泳后， 切下凝胶中含目的条带的胶粒， 放入预先称好、 1PCR 产物经 1.5% 管中。 1.5ml Ep 重量的空 管放在电子天平上再次称重， 计算胶粒的重量。 Ep、将装有胶粒的 2． 3、按 1g 胶加 1ml 的量加入 Binding Buffer ，置于 55℃－ 65℃水浴中约 7min，其间要摇动 Ep 管 2－3 次，使胶粒完全溶解。 4、将上述溶胶液加入到 HiBind spin -colu