冷冻电镜简介[借鉴].pdfVIP

1 冷冻电镜发展背景 人类基因组计划的完成，标志着科学已进入后基因组时代。虽然大量的基因序列得到 阐明，但是生物大分子如何从这些基因转录、翻译、加工、折叠、组装，形成有功能的结 构单元，尚需进一步的研究。后基因组时代人类面临的一个挑战是解析基因产物—蛋白质 的空间结构，建立结构基因组学，并在原子水平上解释核酸—蛋白，蛋白—蛋白之间的相 互作用，从而阐明由这些生物大分子和复合物所行使的生物学功能。在此过程中，结构生 物学在其中扮演着重要角色。对生物大分子结构的解析，不仅具有深远的基础意义，而且 具有广阔的应用前景。通过对核酸、蛋白质及其复合物的结构解析，人们对它们的功能的 理解更加透彻，就可以根据他们发挥功能的结构基础有针对性地进行药物设计，基因改造， 疫苗研制开发，甚至人工构建蛋白质等工作，从而对制药、医疗、疾病防治、生物化工等 诸多方面产生巨大的推动作用 日前用于解析生物大分子空间结构的主要手段是X 射线晶体学技术和核滋共振波谱学 X 射线晶体学可给出分子的高分辨结钩，核磁共振波谱学则可测定分子在溶液中的精确构 像，并可研究构像的动态变化。虽然X 射线晶体学和核磁共振波谱学是解析生物大分子结 构的强有力工具，但各有局限性 X 射线晶体学解析的结构常常是分子的基态结钩，而对 解析分子的激发态和过渡态却往往无能为力：生物大分子在体内常常发生相互作用并形成 复合物而发挥功能，这些复合物的结晶化非常困难。核磁共振波谱学虽可获得分子在溶液 中的结构并可研究结构的动态变化，但目前只能用于分子量较小的生物大分子（<10000 道 尔顿），而对分子量大的生物大分子尤其是超分子复合物却无能为力 人类对生物体系的研究经历了由个体到器官，由器官到组织，由组织到细胞，由细胞 到生物大分子这样一个层次由高到低的过程。随着科学的发展，人们对生物体系的研究又 转向由低层次到高层次，由简单体系到复杂体系。在此过程中，细胞作为生命的基本单位 起着承上启下的重要作用。多少年来，科学家的一个梦想是能观察到生物大分子在细胞内 的行为，几十年来，人们对大量的生物大分子及其复合物应用电子显微镜进行研究，发展 出了强有力的电子显微学来研究生物大分子结构的方法学。近年来，由于快速冷冻和低温 冷却技术的引进，导致了冷冻电子显微学技术的诞生。冷冻电镜在研究生物大分子结构尤 其是超分子体系的结构方面取得了突飞猛进的发展，在生物学领域的应用越来越受到重视， 逐渐成为一种被普遍接受的公认的研究生物大分子尤其是超分子体系结构的有效研究手段， 成为连接生物大分子和细胞的纽带和桥梁 2 冷冻电镜发展过程及分类 2.1 冷冻电镜发展过程 冷冻电子显微镜技术（cryo-electron microscopy ）是在20 世纪70 年代提出的，早在 20 世纪70 年代科学家们就利用冷冻电镜研究病毒分子的结构，首次提出了冷冻电镜技术 的原理、方法以及流程的概念。到了20 世纪90 年代，随着冷冻传输装置、场发射电子枪 以及CDD 成像装置的出现，冷冻电镜单颗粒技术出现 21 世纪初，冷冻电镜技术进一步 发展，利用三维重构技术获得了二十面体病毒的三维结构，但此时冷冻电镜的分辨率水平 依然没有得到突破，这限制了冷冻电镜在生物大分子领域的应用，虽然冷冻电镜和X 射线 晶体学、核磁共振被称作结构生物学研究的三大利器，但不得不承认冷冻电镜是三者当中 最弱的一种技术手段，在现在已解析的一千多种膜蛋白结构当中，90% 以上都采用的是X 射线晶体学方法，核磁共振在小分子量的蛋白结构解析中也发挥了重要的作用，而冷冻电 镜在蛋白结构解析当中所起的作用微乎其微 然而2013 年12 月5 日，美国加州大学旧金山分校副教授程亦凡与同事David Julius 两个实验室合作，采用单电子计数探测器，以近原子分辨率（3.4 埃），确定了在疼痛和热 知觉中起中心作用的一种膜蛋白TRPV1 的结构，这一振奋人心的成果让研究人员们开始 重新审视冷冻电镜在结构生物学研究中的所能发挥的作用。毕竟和X 射线晶体学方法相比， 它所需的样品量很少，也无需生成晶体，这对于一些难结晶的蛋白质的研究带来了新的希 望。蛋白质TRPV1 结构的确定标志着冷冻电镜正式跨入 “原子分辨率”时代 2.2 冷冻电镜分类 目前我们讨论的冷冻电镜基本上指的都是冷冻透射电子显微镜，但是如果我们以使用 冷冻技术的角度定义冷冻电镜的话，冷冻电镜主要可以分为冷冻透射电子显微镜、冷冻扫 描电子显微镜、冷冻蚀刻电子显微镜 2.2.1 冷冻透射电子