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2015年5月 课件作者:蒋华云 DNA重组与转化 * * 一、实验目的 通过本实验学习重组DNA连接与转化的方法。 什么是重组？怎样转化？ 重组：载体和外源连接 什么是载体？ 这里的外源指什么？ 转化 质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 准备好的感受态的细胞（－70度低温保存） 二、实验原理 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。 通常:重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA连接。 T载体: pMD 18-T pMD 18-T (PCR产物克隆载体) 连接 DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶 DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过（牛小肠碱性磷酸酶）CIP处理克服 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中的温度，即12～16℃，连接12～16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定 pMD18-T Vector 是一种高效克隆PCR 产物（TA Cloning）的专用载体，该载体由pUC18 载体改建并在其3’端添加“T”而成 大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率 转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程 重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法 α互补：质粒载体上lacZ’基因编码的α肽段与失去了正常氨基端的β-半乳糖苷酶突变受体菌之间实现互补的现象 由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用Xgal显色测定出来 任何携带着lacZ’基因的质粒载体在转化β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，在含有Xgal的培养基平板上形成蓝色菌落，而含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落 。 蓝斑和白斑 三、仪器、材料与试剂 【仪器】 (1) 超净工作台（417室） (2) 恒温培养箱（412室） (3) 恒温摇床（404室） (4) 台式离心机 (5) 高压灭菌锅 (6) Micro Cooler（16度连接） (7) 移液枪 【材料与试剂】 (1) LB固体和液体培养基 (2) X-gal（20mg/mL）将X-gal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg/mL，不需要过滤灭菌，每份1mL分装，避光贮存于-20℃。 (3) IPTG（200mg/mL）：取2g IPTG溶于10mL双蒸水，用0.22μm滤膜过滤除菌，每份1mL，贮存于-20℃。 (4) 氨苄青霉素（Amp 100mg/mL） (5) pMD18-T Vector（TaKaRa连接试剂盒） pMD18-T Vector*1（50 ng/μL） 20 μL×1 支 Control Insert（50 ng/μL） 10 μL×1 支 Ligation Mix* 30 μL×5 支* 注意：* 使用时请于冰中融解。 (6) 玻璃涂棒 (7) 培养皿（ф9cm） (8) 10μL/1000 μL移液器（配套枪头） (9) 小指管（1.5mL离心管） * * * *
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