PI单染细胞周期检测-protocol(mo--new).docVIP

PI单染检测细胞周期 操作步骤： 1、铺板：5×105 cells/ml，六孔板，每孔1ml。2、血清饥饿法进行细胞同步化处理：无血清培养基培养8-12h，然后才加药。 注意：实验细胞应处于对数生长期，而不能是完全长满，一般在50～80％比较好。自然状态下，不增殖的细胞应该处于G0/G1期。周期特异性药物阻滞哪一期，哪一期就升高，不会使其他阶段细胞增多。 3、收集细胞 悬浮细胞：直接离心收集细胞，弃上清，在4 ℃、1200rpm用预冷的PBS洗细胞2次； 贴壁细胞： 将上清转入离心管（其中含有脱落的凋亡细胞） PBS冲洗液 不含EDTA的0.25%的胰酶消化1-5min后，将细胞吹打成单细胞悬液 将a、b、c合并后1200rpm离心5min；弃上清；用PBS清洗一次，再次弃上清，加入1.5ml PBS重悬细胞； 注：为了既保持初始条件相同，又可搜集到足够的细胞，可选用多孔培养板；在搜集细胞时，浓度大、抑制强的组可多搜集些孔，以保证检测的细胞数量。 4、固定： 将细胞悬液加入预冷（-20℃）无水乙醇3.5ml，使乙醇终浓度为70%，4℃固定过夜。 注意：（1）加入无水乙醇的时候要逐滴、慢速；（2）不是向细胞中加70%乙醇，而是向细胞悬液中加无水乙醇，这样是为了减少细胞聚集；（3）在染色之前细胞4 ℃固定可保存3周； 5、离心收集细胞： 以预冷（4℃）PBS洗细胞一次，调整细胞浓度≧