抗体制备过程[展示].pptVIP

单克隆抗体制备示意图 * 精品PPT | 借鉴参考 一、细胞融合前准备 (一)　免疫方案 　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。 要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。 * 精品PPT | 借鉴参考 初次免疫　 Ag　1～50μg　加福氏完全佐剂皮下多点注射 　　　　　　　　│　　　　　(一般0.8～1ml　0.2ml／点) 　　　　　　　　↓3周后 　　　　　　第二次免疫　剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip) 　　　　　　　　│　　　　　　　(ip剂量不宜超过0.5ml) 　　　　　　　　↓3周后 　　　　　　第三次免疫　剂量同上，不加佐剂，ip 　　　　　　　　│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果) 　　　　　　　　↓2～3周后 　　　　　　加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv(静脉内注射) 　　　　　　　　↓3天后 　　　　　　　取脾融合 * 精品PPT | 借鉴参考 (二)　饲养细胞 　　在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。 * 精品PPT | 借鉴参考 小鼠腹腔巨噬细胞的制备　 小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄 　　　　　　↓ 　　　　　拉颈处死　浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟 　　　　　　↓ 　　　　　用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜 　　　　　　↓ 　　　　　用无菌注射器注入6～8ml培养液 　　　　　　↓ 　　　　　反复冲洗，吸出冲洗液 　　　　　　↓ 　　　　　放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟 　　　　　　↓ 用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1×10５／ml 　　　　　　↓ 　　　　　加入96孔板，100μl／孔 　　　　　　↓ 　　　　　放入37℃　CO2孵箱培养 * 精品PPT | 借鉴参考 一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×106／ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105／ml，均为100μl／孔。 * 精品PPT | 借鉴参考 (三)　骨髓瘤细胞 　　骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量　McAb。 　　常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。　　 * 精品PPT | 借鉴参考 骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超10６／ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。 * 精品PPT | 借鉴参考 一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。 　　保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％，也是决定细胞融合的关键。在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2105/ml，次日一般即为对数生长期细胞。 * 精品PPT | 借鉴参考 (四)　免疫脾细胞 　　免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。 　　脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。 * 精品PPT | 借鉴参考 二、细胞融合，选择杂交瘤 (一)　细胞融合流程 　　(1)　取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。 　　(2)　同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。 　　(3)　将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。 　　(4)　弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响