铜绿假单胞菌检查法.docVIP

深圳康林生物科技有限公司 题目 铜绿假单胞菌检查法 文件编号 SOP- 页 数 PAGE 3 / NUMPAGES 4 深圳康林生物科技有限公司 铜绿假单胞菌检查法 颁发部门：质量管理部 编号： SOP- 页数： PAGE 1 / NUMPAGES 4 制定人 审核人 批准人 分发部门：检验科 年 月 日 年 月 日 年 月 日 生效日期 年 月 日 目的： 建立铜绿假单胞菌检查法的标准操作程序，规范铜绿假单胞菌检查法的操作。 范围： 适用于铜绿假单胞菌检查法。 职责： 检验科主管、检验员。 规程： 1 简述 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），习称绿脓杆菌，为假单胞菌属菌种，广泛分布在土壤，水及空气，人和动物的皮肤、肠道、呼吸道均有存在，故可通过环境和生产的各个环节污染药品。 本菌是常见的化脓性感染菌，在烧伤，眼科及其他外科疾患中常引起继发感染，由于本菌对许多抗菌药物具有天然的耐药性，增加了治疗的难度，国内外药典均将铜绿假单胞菌检查列为检查项目之一。 铜绿假单胞菌按增菌、分离、纯培养、革兰氏染色镜检及生化试验等步骤进行检验。 仪器、设备和用具（见大肠杆菌检验法2） 3 试液、指示液 0.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液 ［附录3.1，3.3］ 1%盐酸二甲基对苯二胺试液 ［附录2.1］ 盐酸试液 ［附录2.12］ 氯仿 ［附录1.57］ 4 培养基 4.1 营养肉汤培养基 ［附录5.1］ 4.2 胆盐乳糖(BL)培养基 ［附录5.6］ 4.3 营养琼脂培养基 ［附录5.2］ 4.4 溴代十六烷基三甲胺 ［附录5.14］ 4.5 绿脓菌素测定用培养基(PDP琼脂) ［附录5.26］ 4.6 明胶培养基 ［附录5.27］ 4.7 硝酸盐胨水培养基 ［附录5.28］ 5 对照用菌液 铜绿假单胞菌〔CMCC(B)10104〕营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内,于36±1℃培养18～24h后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1:106，使对照菌加入量含菌50～100个(一般用量为0.1ml)，菌数在做阳性对照实验的同时用营养琼脂平板涂布经培养后计数确定。 6 操作方法 6.1 供试品的取样量 ［见细菌、霉菌(酵母菌)计数5.3］ 6.2 供试液的制备， ［见细菌、莓菌(酵母菌)计数。6.2］大肠杆菌检查法。 6.3 增菌培养 取胆盐乳糖培养基3瓶，每瓶100ml，2瓶分别加入1：10供试液10ml(相当于供试品1g或1ml)，其中一瓶加入对照菌50～100个作为阳性对照。第3瓶加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。于36±1℃培养18～24h(必要时可延至48h)。阳性对照应生长良好，阴性对照菌应无菌生长。 6.4 分离培养 轻轻摇动上述增菌培养液，以接种取1～2环培养液(如有菌膜应挑取之)，划线接种于溴代十六烷基三甲胺琼脂平板，于36±1℃培养18～24h。铜绿假单胞菌在该培养基平板上的典型菌落为扁平、圆形或无定形、边缘不齐、光滑湿润、呈灰白色,周边略呈扩散现象，在菌落相邻处常有融合现象。菌落周围常有水溶性蓝绿色素扩散，使培养基显蓝绿色，但亦有不产色素的菌株。菌落还有粗糙型和粘液型等，应注意挑选。当阳性对照平板呈典型菌落生长时，供试品平板无菌落生长或无疑似菌落生长，可报告1g或1ml供试品未检出铜绿假单胞菌。制备供试液，以消除供试品抑菌成分的影响。 6.5 纯培养 供试品分离平板生长6.4所述典型菌落或呈疑似菌落时，以接种针轻轻接触单个菌落的表面中心，沾取培养物，应挑取2～3个疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养，作以下检查。 6.6 革兰氏染色镜检 6.6.1 革兰氏染色(见大肠杆菌检验法6.6.1) 6.2.2 镜检 铜绿假单胞菌为革兰氏阴性，无芽孢杆菌，单个，成对或成短链排列。 6.7 生化试验 6.7.1 氧化酶试验 取一小块白色洁净的滤纸置平皿内，以无菌玻璃棒挑取营养琼脂斜面培养物少许，涂在滤纸上，随即滴加1滴