中医药单体化合物中神经氨酸酶抑制剂的筛选以及其抗流感病毒活性的研究.doc

中药单体化合物中神经氨酸酶抑制剂的筛选及其抗流感病毒活 性的研究 流行性感冒是由流感病毒引起的一种具有高度传染性的急性呼吸道疾病。 对 人类健康和生命造成巨大危害 , 同时也给全球的经济带来巨大的损失 , 是人类至 今尚不能控制的世界性传染病之一。 流感病毒是由八条单股负链 RNA组成 , 并具有包膜结构的一类 RNA病毒。流 感病毒按照核蛋白和抗原特性的不同 , 可以分为 A( 甲) 、B(乙) 、C(丙) 三种类型。 在流感病毒表面 , 有两种重要的膜蛋白 : 血凝素 (HA) 和神经氨酸酶 (NA)。 NA 具有糖苷外切酶活性 , 能够催化糖苷键的水解断裂 , 从而使子代病毒从宿主细胞 表面分离。 NA在流感病毒感染、 复制以及脱壳中的重要作用 , 使之成为抗流感病毒最有 效的靶蛋白。目前 , 已被美国 FDA认证的神经氨酸酶抑制剂类药物主要有扎那米 韦、帕拉米韦和达菲 ( 奥司他韦 ) 。 然而 , 流感病毒 NA的突变使得病毒对扎那米韦、 帕拉米韦和达菲产生了抗药 性。所以 , 迫切需要开发新型的抑制 NA药物。 在我国 , 中药防治流感已经有了几千年的历史 , 但是对于中药中具体哪些成 分对流感病毒的 NA有抑制活性和这些成分抗流感作用的机制还缺乏系统深入的 研究。在本论文主要研究以下 5 部分内容 :1. 中药单体化合物文库中神经氨酸酶 抑制剂 (NAI) 的筛选本实验主要采用 NA活性荧光检测法 , 由于甲型流感病毒根据 NA结构的不同 , 可以分为 group-1(N1 、N4、N5、N8)和 group-2(N2 、 N3、 N6、 N7、N9), 所以我们从两类 NA中各选取一种 NA(N1和 N2)作为筛选的 NA。 首先 , 我们从 300 余种中药单体化合物文库中筛选出对 H1N1的 NA(N1)有抑 制活性的化合物 , 然后再从中筛选出对 H3N2的 NA(N2)以及乙型流感病毒 NA有抑 制活性的化合物。通过筛选 , 我们得到了对以上三种 NA均有抑制活性的 4 种化合 物 ; 芦丁、金丝桃苷、盐酸药根碱和羟基红花黄色素。 然后测定化合物对这三种 NA抑制的 IC50 值。2. 筛选出的中药单体化合物在 MDCK细胞及小鼠体内的抗流感活性研究为了检测我们所筛选出的对流感病毒 NA 有抑制活性的中药单体化合物对感染 H1N1和 H3N2病毒 MDCK细胞的保护作用 , 我们首先确定了感染病毒的稀释度 , 即 MDCK细胞感染一半时病毒的浓度 (TCID50) 。 随后 , 我们采用病毒和化合物体外共同孵育后共感染 MDCK细胞 , 以及病毒预 感染 MDCK细胞后再与化合物共孵育两种方法 , 利用 MTT法检测化合物对 H1N1和 H3N2病毒感染 MDCK细胞病变效应 (CPE)的保护作用。 结果表明 , 上述四种化合物 在两种处理方式下对感染 H1N1和 H3N2流感病毒的 MDCK细胞均有保护作用。 随后 , 我们选取了芦丁进行了小鼠体内抗流感活性的研究。我们采用 FM1流 感病毒感染小鼠的模型作为研究芦丁体内抗流感病毒活性研究的动物模型。 实验小鼠随机分成 6 组, 分别为对照组 , 病毒组 , 达菲组以及芦丁低、中、高 剂量组 (50,100,200 mg/kg) 。结果表明 , 芦丁可以减少小鼠因感染流感病毒而引 起的体重减轻。 同时 , 芦丁也能降低患病小鼠的肺指数 , 减少小鼠的死亡率。 以上结果均说明 芦丁对感染流感病毒的小鼠有显著的治疗作用。 中药单体化合物对 N1 和 N2 的抑制机制研究为了研究化合物与 NA结合的 方式 , 我们测定了化合物在不同浓度以及不同底物浓度条件下 N1 和 N2的酶动力 学曲线 , 并利用双倒数作图分析了化合物对 N1、N2 的抑制类型。结果表明 , 芦丁、 金丝桃苷和羟基红花黄色素对 N1的抑制类型为非竞争性抑制 , 盐酸药根碱对 N1 的抑制类型为混合型抑制 ; 它们对 N2的抑制类型与 N1 的类型是相同的。 随后 , 为了确定化合物与 N1 和 N2 的结合位点 , 我们利用分子模拟技术 , 将四 种中药化合物与 N1、N2 进行了分子对接模拟。 首先 , 我们利用 Discovery studio 中的 MODELER程序 , 对未知结构的 NA进行了同源建模并获得了可信度高的模型的。 随后 , 对建模产生的 N1和 N2的结构利用 Autodock 软件与化合物进行分子对 接模拟。结果表明 , 芦丁、金丝桃苷和羟基红花黄色素与 N1和 N2 的结合都发生 NA的非催化区域 ; 而盐酸药根碱在 N1和 N2 的催化和非催化区域都可以结合。以上结果与我们利用酶动力学曲线所测定的抑制类型结果相一致。 在模