多聚免疫球蛋白受体（pIgR）影响猪流行性腹泻病毒复制的分子机理.pdfVIP

摘 要 猪流行性腹泻病毒 （porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）是一种能引起哺乳仔猪严重腹 泻甚至死亡的高度接触性肠道冠状病毒，对当前新生仔猪健康造成了严重的威胁。PEDV 主要 通过靶向入侵猪肠道中肠绒毛上皮细胞，破坏其粘膜免疫系统屏障而引起仔猪发病。分泌型免 疫球蛋白 （sIgs）介导的粘膜免疫应答在控制PEDV 感染过程中发挥着重要的作用，而sIgs 的 分泌主要取决于多聚免疫球蛋白受体（pIgR），因此，探究pIgR 在病毒感染复制过程中的作用， 对解析PEDV 的致病机理具有重要价值。 sIgs 主要依赖pIgR 分泌至肠腔以抵御肠道病原微生物的入侵。为了解pIgR 在PEDV 感染 后的表达情况，我们在前期PEDV FJzz1株感染试验的基础上，选取PEDV 感染组与正常对照 组试验仔猪的不同肠段，检测各肠段中pIgR 的mRNA 变化情况。结果显示，与正常对照组相 比，PEDV 感染组仔猪不同肠段内pIgR 的mRNA 水平均显著增加，表明PEDV 感染后显著上 调宿主体内pIgR 的转录。在体外，我们将PEDVFJzz1株感染宿主细胞LLC-PK1分析了pIgR 表达变化。结果显示，FJzz1株感染12h 后pIgR 的mRNA 显著增加，但与此相反，在病毒感 染18h 后pIgR 的蛋白水平却明显下降。为了探究pIgR 对PEDV 增殖的影响，我们将FJzz1株 感染pIgR过表达的宿主细胞，通过RT-qPCR 以及子代病毒TCID 测定等检测病毒的增殖情况， 50 结果显示，PEDV 的N 蛋白、病毒滴度以及病毒mRNA 均显著增加，表明过量表达pIgR 可促 进PEDV 在细胞内的增殖；而在利用RNA 干扰技术敲低宿主细胞中内源性pIgR 的表达以及缺 失内源性pIgR 的LLC-PK1ΔpIgR 细胞系中，PEDV 的N 蛋白、病毒mRNA 拷贝数和病毒滴度均 显著下降，表明敲低和缺失pIgR表达后可抑制PEDV 的增殖，由此，我们推测pIgR可能在PEDV 感染复制过程中发挥重要作用。 为了分析PEDV 感染后调控pIgR 表达的分子途径，通过检测发现PEDV 感染后TNF-α的 mRNA 明显上调，当采用不同剂量的TNF-α处理LLC-PK1细胞后，发现随着TNF-α剂量的增 加pIgR 表达量也显著上调；当用NF-κB 抑制剂BAY11-708处理后，TNF-α对pIgR 的表达则受 到明显抑制，表明NF-κB 介导的信号途径参与调控pIgR 的表达。进一步分析PEDV 感染后对 NF-κB 信号通路中关键分子的影响，结果显示，当PEDV 感染18 小时后，NF-κB 经典途径中 的IkB-α、p65和替代途径中的p100、P-p100 和p52 均呈下调表达，据此我们推测PEDV 感染 可能通过抑制NF-κB 信号通路下调pIgR 的表达。此外，我们利用蛋白酶抑制剂MG132 处理细 胞后检测了pIgR 的变化情况，结果显示在MG132 存在情况下，pIgR 蛋白水平并没有得到有效 恢复，表明PEDV 感染并非通过泛素蛋白酶体途径降解pIgR。 本研究重点分析了在粘膜免疫反应具有重要作用的pIgR 蛋白在PEDV 感染中的作用，发 现pIgR 的异常表达会影响PEDV 的体外增殖，证实PEDV 感染可通过影响NF-κB 信号通路调 控宿主细胞内pIgR 的表达，为深入了解PEDV 的致病机理提供了新的理论依据。 关键词：猪流行性腹泻病毒，多聚免疫球蛋白受体 （pIgR），NF-κB I Abstract Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), a highly contacting intestinal Coronavirus, causes severe diarrhea or even death in suckling piglets, threatening the health of newborn piglets severely nowadays. PEDV disrupts the mucosal immune barrier by invading t