原位杂交技术原理及其应用[宣讲].ppt

（六）对照实验和ISHH结果的判断 　　和其它实验方法一样，并非ISHH的任何阳性信号都是特异性的，故必须同时有对照试验以证明其特异性。对照试验的设置须根据核酸探针和靶核苷酸的种类和现有的可能条件去选定，常用的对照试验有下列几种 * 精品PPT | 借鉴参考 ISHH对照试验一览表 核乳胶或非放射性检测系统对照试验 Northern 或Southern印迹杂交法 ISHH与免疫细胞化学结合 应用多种不同的核苷酸探针与同一靶核酸进行杂交 将cDNA或cRNA探针进行预杂交（吸收试验） 与非特异性（载体）序列和不相关探针杂交（置换试验） 将切片应用RNA酶或DNA酶进行预处理后杂交 应用同义RNA探针（Sense probe）进行杂交 以不加核酸探针杂交液进行杂交（空白试验） 组织对照用已知确定为阳性或阴性组织进行ISHH对照 应用未标记探针做ISHH，进行对照 * 精品PPT | 借鉴参考 从理论上讲，对照试验设置愈多其靶核苷酸特异性确定愈可靠，但现实是不可能的。因此，在上述对照试验中应任选设至少3～4种用以证实ISHH结果的可靠性。 比较可靠的对照试验: Northern 和Southern印迹杂交法。 用结合的免疫组织化学和ISHH法从蛋白质（或多肽）水平和转录水平在相邻切片或同一切片中证明同一种多肽和相应mRNA共存于同一细胞中。 预先将切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技术证明丢失的是DNA或RNA。 如同免疫组化的吸收试验一样，事先与特异性的cRNA或cDNA进行杂交。再进行ISHH，其结果应为阴性。 由于同义RNA探针和组织内mRNA序列顺序是相同的，应用其进行ISHH，结果应为阴性。 检测系统的对照如乳胶或酶显色系统也应在无标记探针的情况下进行。　 * 精品PPT | 借鉴参考 　ISHH的最大优点是它的高度特异性，它可测定组织、培养的单个细胞或细胞提取物中的核苷酸含量。 应用高敏感度的放射性标记cRNA探针在理想的ISHH的实验条件下检测mRNA，其敏感度可达到20个mRNA拷贝/每个细胞。 由于双链DNA的稳定性，在用ISHH定位DNA时很少发生丢失，降解。在靶核苷酸序列比较伸展的情况如染色体铺片，长于2kb的探针可以应用。因此，其敏感性高到能够出在染色体铺片上，有时甚至在组织切片上的单个基因拷贝。 正因为如此，对ISHH结果的解释应持慎重态度，特别是前人未报告过的新发现。 因为如前所述，影响ISHH实验结果的因素太多，比如在外科或实验取材后未及时的固定或冷冻可由于组织中mRNA的降解而导致假阴性结果。 另外，在各种类型核酸探针进入细胞、组织和各种器官的能力，又叫可接近性（acessiblity）各异。这些诸多因素都将影响ISHH的实验结果。 * 精品PPT | 借鉴参考 1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天????1） 二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；????2） 无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；??? 3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；????4） PBS清洗3分钟；????5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；????6） PBS清洗10分钟；????7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟；??? 8） PBS清洗2次，每次3分钟；????9） 0.2N的HCl孵育30分钟；????10）PBS清洗2次，每次3分钟；????11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；????12）PBS清洗2次，每次5分钟；????13）预杂交缓冲液孵育30分钟；????14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟；???? 原位杂交操作流程 * 精品PPT | 借鉴参考 用原位杂交术，可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。 此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水来探讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。 * 精品PPT | 借鉴参考 Aromase gene The rat brain section In situ hybridization * 精品PPT | 借鉴参考 培养细胞 * 精品PPT | 借鉴参考 原位杂交组织化学技术发展 1961年，Hall 液相核酸杂交技术 1969年，Gall 和Pardue 用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。 1969年，Buongiorno-Nardelli和Amaldi John 利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，创造了原位杂交细胞或组织化学技术。 Orth（1970）应