Western_Blot详解及问题分析[宣讲].pptVIP

灌制积层胶 插入梳子 Staking gel Separating gel 转膜 要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。 常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。 转移膜的选择 最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。 各种膜的详细特点介绍： /bio101/2008/21461_2.htm 湿转系统 半干转移系统 丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。 转膜后检测（此步可以省略） 封闭 为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。 5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h） Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司） Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。 一抗、二抗孵育 把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。 二抗与底物反应显色 辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法(HRP) 膜解吸方法（膜的重复利用） 通过加热和去污剂进行解吸 原理：组合使用去污剂和加热使抗体解离，适用于任何化学发光底物系统。 酸解吸 原理：使用低pH改变抗体结构从而使结合位点失活，从而将抗体与抗原分离，适用于任何化学发光底物系统。 * 8. 膜的重复利用(Membrane recovery) 如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。 两种方法都不能去除由显色检测系统产生的有色沉淀物（例如BCIP、4-CN、DAB和TMB）。然而，仍可以用针对不同靶蛋白的特异性抗体分析印迹膜。 重要提示：在各次免疫检测之间不应使印迹膜干燥。印迹膜干燥将会使任何剩余抗体与膜永久性结合。 通过加热和去污剂进行解吸 仪器和溶液： 解吸液：100mM 2-巯基乙醇，2%（w/v）SDS，62.5 mM Tris-HCl，pH6.7 磷酸盐缓冲液（PBS）：10mM 磷酸钠，pH7.2，0.9%（w/v）NaCl 浅托盘，大小足以将膜放入其中。 操作： 1. 在通风橱中，将印迹膜放入解吸液中在50℃下振摇30分钟。 2. 将印迹膜放入缓冲液中振摇10分钟。用新缓冲液重复漂洗两次。 3. （可选）重复起始检测方法（忽略一抗步骤），确保已灭活抗体或已从膜上解吸抗体。 4. 将印迹膜放入缓冲液中振摇10分钟。 5. 继续下一轮检测的封闭步骤。 酸解吸 仪器和溶液： 解吸液：25mM 甘氨酸- HCl，pH2，1%（w/v）SDS 磷酸盐缓冲液（PBS）：10mM 磷酸钠，pH7.2，0.9%（w/v）NaCl 浅托盘，大小足以将膜放入其中。 操作： 1. 将印迹膜放入解吸液中振摇30分钟。 2. 将印迹膜放入缓冲液中振摇10分钟。用新缓冲液重复漂洗。 3. 继续下一轮检测的封闭步骤。 精品PPT | 借鉴参考 精品PPT | 借鉴参考 * 9. 结果分析(Result Analysis) 内参即是内部参照，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。 在Western Blot中使用内参其实就是在WB过程中另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。 常用的蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin