单克隆抗体的制备.docx

单克隆抗体的研制 一、单克隆抗体的概念 抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。 常规的抗体制备是通过动 物免疫并采集抗血清的方法产生的， 因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白 质成分。 一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇， 所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定 簇抗体的混合物。 即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体， 仍是由不同 B 细胞克隆产生的异质的 抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（ polyclonal antibody ），简称多抗。由于常规抗体 的多克隆性质， 加之不同批次的抗体制剂质量差异很大， 使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。 因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目 标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975 年， Kohler 和 Milstein 建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细 胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合， 形成 B 细胞杂交瘤。 这种杂交瘤细胞具有双亲细 胞的特征， 既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死， 又能像脾淋巴细胞那样 合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所 产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（ monoclonal antibody ）， 简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世， 不仅带来了免疫学领域里的一次革命，  而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，  促进了 众多学科的发展。 Kohler  和  Milstein  两人由此杰出贡献而荣获  1984 年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一） 杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果， 抗体生成的 克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技 术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮 备。 1975  年 8 月  7 日， Kohler  和  Milstein  在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性 抗体的融合细胞的持续培养”  （ Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined  specificity  ）的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失 合成次黄嘌呤  - 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（  hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase  ， HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞 通过在含有次黄嘌呤 （hypoxanthine  ，H）、氨基喋呤 （ aminopterin  ，A）和胸腺嘧啶核苷 （ thymidine  ， T）的培养基（  HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合 的脾细胞是  HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的  HGPRT骨-髓瘤细胞和 相互融合的 HGPRT骨-髓瘤细胞不能在 HAT 培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细 胞因得到分别来自亲本脾细胞的 HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性， 而在 HAT培养基中存活下 来。实验的结果完全像起始设计的那样， 最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞 系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量 同质的抗体，即单克隆抗体。 这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用 做融合剂，后来发现聚乙二醇（ PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的 应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如 SP2/0-Ag14 ，和 NSO/1 都是既不合成轻链又不合成重链的变种， 所以由它们产生的杂交瘤细胞系， 只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子， 克服了骨髓瘤细胞 MOPC-21 等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是一 样的。 （二） 基本程序和方法 杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者所在实验 室采用的、实践证明成熟的程序