《血清学实验技术》.pptVIP

第二十四章 血清学试验;第一节 血清学反应概论;一、血清学反应的一般规律 二、血清抗体的制备原则 三、影响血清学反应的因素 四、血清学反应的应用;一、血清学反应的一般规律;范德华力 抗原抗体互补空间关系有助于该力发挥作用。 静电引力 氨基与羧基 氢键结合力 大于范德华力 疏水作用 抗原抗体分子上非极性氨基酸，提供的作用力最大 ; 比例适合才出现最强的反应。沉淀反应 抗原抗体反应的等价带: 最适比时，抗原抗体结合充分，沉淀物形成快而多，上清中存在少量游离。 带现象：如抗原或抗体过剩，其结合价不能相互饱和，则抗原与抗体仅能形成小分子的复合物，不出现肉眼可见的反应。 ;非共价键结合，一定条件下可解离 结合强度取决于特异性抗体Fab片段与抗原决定簇立体构型的吻合程度 稀释和冻融可使复合物解离 解离与否：1、亲和力；2、环境因素 （pH、离子强度）;第一阶段：特异性结合；时间短，数秒到数分钟 第二阶段：可见反应阶段，表现为凝集、沉淀等可见反应；时间长，数分钟到数日;二、血清抗体的制备原则;2.抗原及佐剂 (1) 免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动物的个体状态、免疫时间、所要求的抗体特性来确定。 首次免疫时，剂量不宜过大或过小，以免产生免疫耐受或不能形成足够刺激。 高特异性－低剂量短程免疫；高效价－大剂量长程免疫 (2)免疫佐剂: 某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型，此类物质称为免疫佐剂(immunoadjuvant)，简称佐剂。 ;佐剂的种类 佐剂一般包括以下几类： ①无机佐剂： 如氢氧化铝、明钒等 ②生物性佐剂： 如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等； ③人工合成佐剂： 如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）； ④油剂： 如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等； ⑤纳米佐剂 ; 弗氏佐剂（Freund’s adjuvant）,分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种： 前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化剂（羊毛脂或吐温-80）按1：1～1：5比例混合而成； 后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在免疫动物时，先将弗氏佐剂与抗原等比混匀，制成“油包水”乳化液。 ; 佐剂与抗原混合乳化的方法： 研磨法 搅拌混合法;佐剂的免疫生物学作用 ①增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的物质变成持久或强的免疫原； ②增强机体对抗原刺激的反应性，提高初次应答和再次应答所产生的抗体滴度； ③改变抗体类型，使产生抗体由IgM型转变为IgG型； ④引起或增强迟发性超敏反应。;佐剂的作用机制 佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种： ①可增强抗原的表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性。 ②佐剂与抗原混合一起注入机体，可改变抗原的物理性状，形成抗原储存库，延长抗原在局部组织的滞留时间，有利于抗原的缓慢释放。 ③增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被吞噬细胞吞噬），促进对抗原的处理，刺激淋巴细胞增生，从而增强和扩大免疫应答的效应。 ; 3. 免疫途径与免疫间隔时间 免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结等，视不同的免疫方案而异。对于不易获取的宝贵抗原可采用淋巴结免疫法。 免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因素，其中首次与第二次免疫的间隔时间尤为重要，一般以10～20天为佳，二次后间隔时间一般为7～10天，若间隔时间太长，则刺激减弱，抗体效价不高。 ;4. 免疫血清的保存 ;三、影响血清学反应的因素;三、影响血清学反应的因素;（3）电解质 亲水变疏水，降低抗原抗体的电势，利于二者结合 （4）pH值 pH6.0～9.0均可以，常用 pH7.0～7.2。 抗原抗体蛋白的等电点在 pH6以下，若抗原或抗体溶液pH接近等电点，自身就会凝聚，出现非特异性的凝集或沉淀反应。设立阳性、阴性和空白对照。 （5）温度：15～400C均可，温度低反应慢，温度高反应快。最常用370C 30min。 （6）时间 反应速度：亲和力、类型、介质、温度等，液相中抗原抗体很快达到平衡，但在琼脂中就慢。 （7）杂质异物 反应中如存在有与反应无关的蛋白质、类脂质、多糖等，往往会抑制反应进行，或引起非特异性反应。;四、血清学反应的应用;第二节 血清学反应类型;一、凝集反应;（一）直接凝集试验;;2.试管凝集试验;（二）间接凝集试验;正向间接凝集试验（检测抗体）、反向间接凝集试验（检测抗原）间接凝集抑制试验、协同凝集试验;抗球蛋白实验 机体受某些抗原刺激后，可产