试验改良Lowry氏法测蛋白含量.pptVIP

生物化学与分子生物学系 陈园园 yuanyuan_work@ 生物化学实验 实验室规则 按规章操作，保障实验安全； 进入实验室要着白大衣； 禁止大声喧哗，保持实验环境的安静； 维持实验室的整洁。 ? 实验课的考试 ? 实验分组 ? 实验室卫生 ? 实验报告的书写 实验名称 姓名： 班级： 学号： 实验原理： 实验目的： 实验步骤： 文字简洁，尽可能采用图表 实验结果： 原始数据、计算过程、结论 实验讨论： 结果分析、实验注意事项 实验日期： 同组人员： 实验报告的书写 一、玻璃仪器的常规清洗 二、试剂瓶、吸量管、试管的放置 基 本 操 作 三、刻度吸量管的使用 分光光度计 分光光度计的原理 分光光度计的操作 T = I/I 0 ， A = - lg T 1 、 A 1 /A 2 = c 1 /c 2 2 、标准曲线法 Lambert-Beer 定律 A = KcL 分光光度计的原理 I 0 I L K ：吸光系数 c ：溶液浓度 L ：溶液厚度 C 光 源 I 0 I 单色器 样品池 狭缝 检测系统 分光光度计的构造 分光光度计的使用 1. 打开电源，调节旋钮至需要的波长，预热 20~30min 2. 1 档（空白管）， T 模式调 100% ，显示“ Blank ”、“ 100 ” 3. 拉杆拉至 1.5 档， T 模式调 0% ，显示“ 0.00 ” 4. 切换到 A 模式，拉至 2 、 3 、 4 档，读取各个样品的吸光度 5. 使用完毕后，置于休息档（ 1.5 档） 拉杆， 1-4 档 样品池 读数 波长 1 档，空白对照， A=0 ， T=100% 1.5 档，隔板， A=+ ∞ ， T=0% 2 档，样品 1 ， A= ？ 3 档，样品 2 ， A= ？ 4 档，样品 3 ， A= ？ 1 、分清光面、毛面 手只可接触毛面，光线须从光面通过 2 、用溶液润洗 2-3 次，装至 2/3 至 4/5 体积 3 、粗纸吸水、柔纸擦亮光面 4 、从低到高依次测量，不需清洗比色杯 5 、蒸馏水冲洗 3-5 次，擦干，倒扣放置 比色皿的使用 毛面 光面 改良 Lowry 氏法测定 蛋白质含量 实 验 1 实 验 目 的 1 、学习改良 Lowry 氏法测定蛋白质含量 的原理及方法 2 、了解标准曲线在物质定量测定中的 应用及绘制要点 实验原理 凯氏定氮法 16% 紫外吸收 280nm 呈色反应 Pr. Cu 2+ OH - Pr-Cu 2+ 螯合物 ( 紫红色 ) 酚试剂 钼蓝 - 钨蓝混合物 ( 蓝色，深浅与蛋白含量呈正比 ) （双缩脲反应） Pr. Cu 2+ 改良 Lowry 法 费时较长，而且要精确控制操作时间。 显色程度与时间有关。 专一性较差，干扰物质较多。 灵敏度高 双缩脲法的检出限为 0.2~1.7 mg/ml ， 而本法的检出限为 0.015~0.110 mg/ml 。 优 点 缺 点 实 验 步 骤 试剂 （ ml ） 蛋白标准品 样品 测定管 0 1 2 3 4 5 Pr 标准液 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 待测血清 1.0 生理盐水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 试剂 A 0.9ml, 混匀后， 37 ℃水浴 10min 试剂 B 0.1ml, 混匀后，室温放置 10min 试剂 C 3ml, 立即 混匀， 37 ℃水浴 10min