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实验八 植物细胞悬浮培养 实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。 实验器材： 超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培 养瓶、 250 mL 、 500 mL 三角瓶、镊子、酒精灯等。 配置 MS液体培养基（ 2 ，4-D 2 mg/L+ 1%甘露醇 +3% 蔗糖， pH 5.8 ）分装于 250ml 的三角瓶中，每瓶 50ml 。 实验材料：烟草叶片愈伤组织。 实验方法： 1.70% 乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等 放入工作台。 打开紫外灯和风机， 15 分钟后关闭紫外灯开始方可 操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入 150ml 三角瓶中并轻轻夹碎 , 每个三角瓶加入培养基 20-30ml ，每 瓶接种 1-2g 愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基 1 ∶10 的比例， 以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3. 接种后的三角瓶用天平称取重量并记载， 然后置于摇床上， 在转速 100-120rpm ，25 ℃下培养以及散射光条件下， 进行振荡悬浮培养。 4. 每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换 1/3 。每次更换新鲜培养 基时称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞 1 瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养 7 天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动 态，可用以下方法绘制生长曲线图： 鲜重法： 在转代培养的不同时间， 取一定体积的悬浮培养物， 离 心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标， 绘制鲜重增长曲线。 烟草遗传转化实验 实验目的 烟草是遗传转化的模式植物， 已经建立了一套完善的转化再生体系。 本实验以烟草为实 验材料，了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。 实验要求： 掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化 的机理；了解转基因植物筛选的方法。 实验原理 根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质 粒，简称为 Ti 质粒。野生型农杆菌的 Ti 质粒，含有两个与致瘤有关的区域： 一个是 T － DNA 区，含致瘤基因；另一个是毒性区，在 T － DNA 的切割、转移与整合过程中起作用。用于 植物基因转化的农杆菌 Ti 质粒载体系统的构建，是将野生 Ti 质粒中的致瘤基因删除，并在 T － DNA 区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。 p BI121 载体是常用的植物表达载体，载体的骨架是 pUC18 ， 以 CaMV35S 启动子驱动 的新霉素磷酸转移酶基因 NPTII 为卡那霉素（ kan ）抗性选择标记基因， 含有卡那霉素抗性 基因作为筛选基因。 β－葡萄糖苷酶 gus 基因作为报告基因， 转化的获得的转基因细胞、组 织或植株，具有抗卡那霉素的特性，经组织化学染色呈蓝色。 实验器材 摇床、超净工作台、小型离心机、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、酒精灯、棉球、培养 皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。 实验材料 植物材料：烟草无菌苗 农杆菌与载体：农杆菌 LBA4404 p BI121 YEB 培养基： 牛肉膏