试验血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳参考幻灯片.pptVIP

实验三 血清蛋白质 醋酸纤维素薄膜 电泳 1 注意：自己带 铅笔 、尺子 实验时间：第 11 周，星期一 2 一、实验目的 1. 了解电泳的基本原理； 2. 掌握电泳分离蛋白质的原理； 3. 掌握醋酸纤维素薄膜电泳的方法。 3 二、实验原理 1. 电泳的基本原理 电泳 ——是带电质点在电场力作用下发生定 向移动的现象。 电泳技术 ——是利用电泳现象进行物质分离、 纯化及鉴定的技术。 4 电泳速度的方向： 电泳速度的大小：当 F=F 时，粒子在电场中匀速运动。 V = QE 6 π ? r ? – 正 极 负 极 F ′ F F = F ′ 电场力 F=QE 摩擦力 F ′ = 6 π ? rV QE= 6 π ? rV 运动速度 5 ? ? r EQ v 6 ? E ：电场强度 ; Q ：粒子所带的净电荷 ; r ：粒子半径； η：溶液的粘度 在同一电场环境中，带电粒子的迁移速率只与本 身 所带电荷 、 粒子半径 有关。 6 ? （ i ）粒子所带电荷越多，半径越小，泳动速度就越快 ? （ ii ）所带电荷越少，半径越大，泳动速度就越慢 ? ? r EQ v 6 ? 7 2. 电泳分离蛋白质的原理 COOH NH 3 + Pro COO – NH 3 + Pro COO – NH 2 Pro pH ? pH ? pI 碱性电离 酸性电离 ? 当 pH=PI 时，所带电荷为 0 ，粒子是静止的； ? 当 pHPI 时，酸性电离，释放氢离子，带负电，运动方向 是从负极向正极移动； ? 当 pHPI 时，碱性电离，结合氢离子，带正电，运动方向 是从正极向负极移动； ? 当 pH 距离 PI 越远时，所带电量越多。 8 血清蛋白质的等电点为 4.8 ～ 7.5 ，均低于 8.6 ，因此电泳 时常采用 pH8.6 的缓冲液。此时，蛋白质解离带 负电荷 ，在 电场中向 正极 移动。 由于各种血清蛋白的 等电点不同 ，在同一 pH 下带的电荷 数也不同，加上各蛋白质的 分子大小 也有差别，因此在电场 中的移动速度不同。 带电荷多、相对分子量小的蛋白质泳动较快，带电荷少、 相对分子量大的泳动较慢。 这样各种血清蛋白质在同一时间内泳动的距离就不同，从 而可将血清蛋白分离成数条区带。 2. 电泳分离血清蛋白质的原理 9 4. 醋纤膜分离血清蛋白质的原理 醋酸纤维素薄膜电泳 是采用醋酸纤维素薄膜作支 持物的一种电泳技术。 醋酸纤维素薄膜 是纤维素的羟基乙酰化形成的纤 维素醋酸酯，具有均一的泡沫状结构，渗透性强， 对分子移动阻力小，用它做区带电泳的支持物，用 样量少，分离清晰，对染料无吸附作用，应用范围 广，快速简便 , 且染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸 溶液浸泡透明，透明后的薄膜便于保存和定量分析。 因此，目前被广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红 蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。 10 醋纤膜分离血清蛋白质的方法 以醋酸纤维素薄膜作为支持介质，于薄膜一端 加微量血清，膜两端连接于缓冲液。电泳分离后 再经染色处理，可将血清蛋白质分成五条主要的 区带，从正极依次为 清蛋白、α1 - 球蛋白、α2 - 球蛋白、β - 球蛋白、γ - 球蛋白 。 11 三、主要试剂与器材： ? 试剂：血清 巴比妥缓冲液 染色液，漂洗液 ? 器材：电泳仪，电泳槽 醋酸纤维素薄膜（ 2 × 8cm ） 血清加样器 12 四、操作步骤： 1. 浸膜：将裁好的醋酸纤维素薄膜浸泡于 缓冲液 中， 充分浸透后用镊子取出用两片滤纸吸干（约 20min ， 直到 膜上没有斑点，中间没有气泡 为止）。 2. 点样： 毛面向上 ，用点样器，在距膜一端约 2cm 处， 与边缘平行直线状点加3~5μL待分离血清。注意取 样适量、均匀；血清线位置适当，粗细均匀，不能 有明显扩散现象。 2cm 13 不同的点样方式 ? 正确点样：直、细 - + 姓 名 2cm 14 2cm - + 姓 名 × 错误的点样方式：量多、条带粗 - + × 结果 ： 15 2cm - + 姓 名 × 错误的点样方式：量少，条带不清晰 × 结果 ： - + 16 2cm - + 姓 名 如何正确点样： 1 ～ 3mm 宽的细长、均 匀、连续条带 （ 1 ）移液器的尖嘴：旁边不沾液滴； （ 2 ）移液器的尖嘴蘸点血清后，较快划一次。 血清的高度：决定 尖嘴液面的高度 → 决定 血清线漫开的 宽度 。 17 3. 搭桥：首先将双层滤纸铺好，分别放置于电泳槽两 端，其下端要浸入缓冲液中。 注意： ? 无光泽面朝 下； ? 血清线不碰到盐桥上的滤纸； ? 膜的 + ”“ - ” 与电泳槽的“ + ”极、“ - ”极方向一致。 醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图 18 水平电泳槽 19