大肠杆菌mRNA膜周定位对其降解速度的影响.pdfVIP

大肠杆菌mRNA 膜周定位对其降解速度的影响 摘 要 mRNA 转录与降解之间的平衡是调节mRNA 丰度、调控基因表达的有效手段， 对于生命体实施正常的生理功能具有重要意义。真核生物与原核生物 mRNA 降解方 式包括：内切酶降解、5’→3’方向外切酶降解和3’→5’方向外切酶降解3 种方式。细 菌中最主要的降解途径是内切酶降解。核糖核酸酶E （Ribonuclease E ，RNase E ）是 参与RNA 转录后处理和mRNA 降解的重要核糖核酸内切酶，是大肠杆菌mRNA 降 解途径的关键组成部分。RNase E 中存在一个片段 （Segment-A ，SA ），是RNase E 与细胞膜结合的必要且充分条件。体内和体外实验的结果均表明该片段的破坏会导致 RNase E 失去膜结合能力。PUF 家族蛋白是一类高度保守的RNA 结合蛋白，其包含 一个进化上高度保守的RNA 结合结构域，能特异性识别、结合特定RNA 序列。科 学家已经分析出PUF 蛋白氨基酸序列与识别核苷酸序列的对应关系，为人工设计PUF 蛋白并应用于识别结合特定RNA 序列奠定了基础。 为了探究大肠杆菌内膜周围mRNA 降解速度是否与其它位置有所不同，本研究 分别设计了结合ompC 和gapA mRNA 3’非翻译区的PUF 蛋白，并通过在PUF 蛋白氨 基端加上内膜定位片段，引导结合对应目标基因序列的PUF 蛋白定位到内膜附近， 进一步通过分析ompC 和gapA mRNA 含量与PUF 蛋白表达的相关性，得到大肠杆菌 胞内mRNA 内膜周定位是否影响其降解速度的结论。 利用片段 SA 将 PUF 蛋白定位至大肠杆菌细胞内膜，并利用绿色荧光蛋白作为 信号方便PUF 蛋白的定位分析。分别构建PUF1-GFP 和SA-PUF1-GFP 融合蛋白的原 核表达载体，在大肠杆菌中分别诱导融合蛋白表达后，利用激光共聚焦显微镜观察融 合蛋白在大肠杆菌胞内的分布，结果发现SA-PUF1-GFP 融合蛋白相较于PUF1-GFP ， I 摘要 其在大肠杆菌内所处位置明显更靠近大肠杆菌内膜。此结果说明SA 片段发挥了内膜 定位功能，成功将PUF1-GFP 融合蛋白定位到大肠杆菌内膜。 选择合适的大肠杆菌内源目标mRNA 分子，并在体外验证PUF 蛋白与目标RNA 分子的互作。利用定量 PCR 技术，分析了 ompC ，gapA ，aspC 和 recA 四种基因的 mRNA 表达水平，确定相对表达量较高且分别主要分布于细胞膜和细胞质的ompC 和 gapA 为mRNA 目标分子。分别在ompC 和gapA 的3’非翻译区 （untranslated regions ， UTR ）中选择合适的序列作为PUF 蛋白识别序列，并设计合成PUF5 （识别ompC 3’ 非翻译区5’-GCGGGCCC-3’ ），PUF6 （识别gapA 3’非翻译区5’-AGAGCGAC-3’ ）核 苷酸序列。为了方便后续 PUF 蛋白与目标寡核苷酸的互作分析，我们设计利用青色 荧光蛋白（cyan fluorescent protein ，CFP ）荧光和FAM 形成荧光能量共振转移对（FRET pair ），一旦他们结合，会产生较明显的信号。我们分别构建PUF5-CFP 和PUF6-CFP 融合蛋白的原核表达载体，并通过原核表达、纯化获得相应的融合蛋白。为了分析寡 核苷酸6-FAM 标记与PUF 蛋白目标寡核苷酸的距离对其互作的影响，我们设计合成 了6-FAM 修饰与目标寡核苷酸之间有 5，10，15，20 和 25 个腺苷酸的寡核苷酸链 （6-FAM-A5-25-GCGGGCCC/AGAGCGAC ）。通过 PUF-CFP 与 FAM-寡核苷酸链的 FRET 实验，结果表明PUF5 和PUF6 蛋白识别、结合其目标RNA 序列，且在识别序 列与 6-FAM 之间间隔 10 个腺苷酸时亲和力最强，Kd 值分别为 0.45 mol/L 和 0.52 mol/L 。 在