生物化学方法与其在中医研究中的应用.ppt

2018.12.12;作者和所在科室介绍。 引言部分比较全面完整地介绍了生化的发展历程，及其灿烂的里程碑。仔细阅读，有利于我们更好地理解这门学科，及其技术。 生物化学是运用化学理论和技术来研究组成生物体的基本成分及其在生物体内所进行的化学变化规律的一门学科，从而揭示生命现象的化学本质。;生物化学的发展可以分为静态生化、动态生化和功能生化三个阶段，这三个阶段并不是截然分开的，它反映了人们对生命活动认识的深入过程。 静态生化，主要指以分离、制备、纯化和检测某物质。 动态生化，主要指活体内的化学反应，及其动态平衡。 功能生化，主要指研究某化学物质分子结构与功能的关系（P169）。 从发扬中医学角度来说，掌握生物化学理论和技术，不仅能更深刻理解人体的生长、发育、壮盛、衰老等问题，而且从蛋白质、核酸的分子结构变化来探讨疾病的诊断、治疗和预防，无疑会起到如虎添翼的作用。 ;一、生物化学的主要方法 生物化学技术是研究生物内物质的化学组成、结构、功能以及在生命过程中化学物质代谢变化规律，调节控制等的实验方法。 常用的生物化学技术主要有物质的分离、提纯法，离心法，层析法，电泳法，光谱法以及分子杂交技术等。 ;（一）生物大分子物质的分离和提纯 生物大分子主要指蛋白质、核酸、糖类和脂类等物质。制备高度纯化的生物大分子是研究大分子结构与功能的前提，整个分离提纯过程可分为以下几个阶段：1）材料选择。2）细胞破碎。3）亚细胞器的分离。4）提取。5）分离纯化。6）浓缩、干燥及保存。 1．材料选择。原则：选取所需成分含量较高、来源丰富、工艺简单、成本低廉的目的材料或组织。（这是指分离、纯化、制备某种物质而言的，具体中医药实验有具体要求）; 2．细胞破碎。常用的技术有：匀浆器研磨、高速组织捣碎器、反复冻融、超声波破碎、自溶、酶消化、表面活性剂处理法等。;3．亚细胞器的分离。一般采用不同密度梯度介质，经差速离心法制备。 4．提取。提取过程，首先要使生物大分子与其他物质分离开来，使大分子物质充分释放出来，在此过程中，特别要考虑??剂性质、pH值、离子强度、介电常数、抽提温度等多种影响溶解度的因素，然后可结合经验并根据具体实验条件灵活地选取某一试剂进行提取。 5．分离纯化。刚提取得到的大分子物质，往往是粗制品，含有许多杂质，必须进一步分离纯化。分离提纯各种生物大分子，主要根据各种物质的分子大小、溶解度、带电性、亲和力大小等差异，选用有机溶剂沉淀、等电点沉淀、盐析、层析、电泳、超离心、吸附、结晶等方法。以下会详细介绍。;左图 真空冷凝干燥仪 右图 超低温冰箱;（二）离心技术 离心技术是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒（指悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等）发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。 离心机转子高速旋转时，当悬浮颗粒密度大于周围介质密度时，颗粒离开轴心方向移动，发生沉降；如果颗粒密度低于周围介质的密度时，则颗粒朝向轴心方向移动而发生漂浮。 常用的离心机分类： “低速离心机”最高转速不超过6000rpm. “高速离心机”在25000rpm以下. “超速离心机”达30000rpm以上。;冷冻离心机构造图;左上：普通台式离心机。 左下：冷冻台式离心机。右：超速离心机。;左图：不同离心机的不同转头 右图：超速离心机的不同转头;离心方法主要有三大类型：差速离心、密度梯度离心、沉降平衡离心。 1．差速离心法。通过逐步增加相对离心力，使一个非均相混合液内形状不同的大小颗粒分步沉淀。 2．密度梯度离心法。离心前，离心管内先装入分离介质（如蔗糖、甘油等），使形成连续的或不连续的密度梯度介质，然后加入样品进行离心，具体又可分为： （1）速度区带离心法。离心前，离心管内先装入蔗糖、甘油、CsCl、Percoll等密度梯度介质，待分离样品铺在梯度液的顶部，离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心，利用各颗粒在梯度液中沉降速度或漂浮速度的不同，使具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。本法可分离各种细胞、病毒、染色体、脂蛋白、DNA和RNA等生物样品。;（2）预制梯度等密度离心法。要求在离心前预先配制管底浓而管顶稀的密度梯度介质，常用介质有蔗糖、CsCl、Cs2SO4等，待分离样品一般铺在梯度液顶上，如需挟在梯度液中间或管底部，则需调节样品液密度。离心后，不同密度的样品颗粒到达与自身密度相等的梯度层，即达到等密度的位置而获得分离。 （3）自成梯度等密度离心法。某些密度介质经过离心后会自成梯度，例Percoll，可迅速形成梯度，CsCl、Cs2SO4和三碘甲酰葡萄糖胺经长时间离心后也可产生稳定的梯度。需要离心分离的样品可和梯度介质先均匀混合，离心开始后，梯度介质由于离心力的作用逐渐形成管底