益气活血解毒方治疗晚期上皮性卵巢癌疗效相关靶基因筛选.doc

益气活血解毒方治疗晚期上皮性卵巢癌疗效相关靶基因筛选 　　李娟翁洁琼卢雯平 　　摘要：目的?采用mRNA芯片探究益氣活血解毒方维持治疗晚期上皮性卵巢癌（AEoc）气虚血瘀证疗效相关基因靶点，明确其有效作用机制。方法?观察AEoc气虚血瘀证患者服用益气活血解毒方维持治疗后的无进展生存期（PFS），选取PFS最长的8例为敏感组，PFS最短的8例为不敏感组。采用mRNA芯片检测2组患者治疗后血液mRNA表达情况，并对差异表达基因进行Go、kEGG、singal-net、path-net生物信息学分析，实时荧光定量PcR（qRT-PcR）验证。结果?益气活血解毒方疗效相关差异表达基因共1157个（P），具有可比性，见表1。本研究经中国中医科学院广安门医院伦理委员会审查批准（2014Ec035）。 　　?西医诊断标准 　　参照《中国常见恶性肿瘤诊治规范》[7]，根据症状、体征、影像学检查，并经细胞学和/或组织学检查确认，选取Ⅲc/Ⅳ期的AEoc患者。分期采用2014年国际妇产科联盟（FIGo）分期[8]。 　　?中医辨证标准 　　参照《中药新药临床研究指导原则（试行）》[9]制定气虚血瘀证辨证标准。症见乏力，气短，疼痛，肤色晦黯;舌脉：舌黯，有瘀斑，舌下静脉青紫，舌苔薄白或有齿痕，脉弱而涩。 　　?纳入标准 　　①符合上述西医诊断标准及中医辨证标准;②年龄18～80岁;③完成减瘤术未超过6个月;④完成6～8个周期的铂类加紫杉醇类化疗未超过1个月;⑤患者对本研究知情，并签署知情同意书。 　　?治疗方法 　　患者均予益气活血解毒方，药物组成：黄芪30g，女贞子15g，枸杞子15g，白术15g，山药15g，三棱6g，莪术9g，青皮6g，乌药6g，肉桂6g，白花蛇舌草15g，青蒿12g。饮片由中国中医科学院广安门医院药房提供。每日1剂，水煎取汁300mL，早晚各1次口服。服药半年后（若半年内疾病进展则在进展时进行）抽取外周血10～15mL，采用mRNA提取试剂盒提取mRNA后保存。每3个月随访1次，随访至疾病进展或至2018年12月研究结束。 　　?mRNA提取及芯片检测 　　采用IANGENRNAprepPure血液总RNA提取试剂盒从患者外周血样中提取总RNA，使用Genechip3IVTPLUSReagentkit将总RNA制备为纯化aRNA，并将其片段化后与Genechip?PrimeViewTmHumanGeneExpressionArray芯片探针杂交、洗染、扫描等得到图片和原始数据，筛选P的基因為差异表达基因。 　　?生物信息学分析 　　为全面直观地展示2组基因表达的关系及差异，将差异表达基因做无监督层次聚类分析，以热图形式显示。应用基因本体论（Go）分析差异表达基因的主要功能，Go分析根据差异表达基因的分子功能和生物过程将基因分为不同层次类别，以揭示差异表达基因调控网络[10]。利用京都基因与基因组百科全书（kEGG），分析差异表达基因的显著通路[11]。根据kEGG数据库中信号通路的上下游关系，建立各通路间的相互作用网络（path-net）分析[12]。基于Go和kEGG分析，建立全局信号转导网络（signal-net）分析差异表达基因间的相互作用，以分析得到核心关键基因[13]。 　　?实时荧光定量PcR 　　实时荧光定量PcR（qRT-PcR）采用Trizol试剂（LifeTechnologies）从血液样本中分离总RNA，用反转录试剂盒（Takara）转录至cDNA。采用SyBRGreen试剂（Bio-Rad）平行测定3次。采用2-ΔΔct法通过相对定量方法比较2组mRNA表达量。 　　?统计学方法 　　采用统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，2组PFS比较采用非参数估计（mann-whitneyU检验）;计数资料采用卡方检验，2组一般资料比较采用Fisher确切概率法;等级资料采用秩和检验。P<表示差异有统计学意义。 　　2?结果 　　?疗效相关差异表达基因及聚类分析 　　经益气活血解毒方治疗，2组mRNA芯片检测得到差异表达基因1157个，其中上调基因497个，下调基因660个。聚类图见图1。 　　?疗效相关差异表达基因基因本体论分析 　　对疗效相关差异表达基因行Go分析。前10个上调基因涉及核转录mRNA分解代谢过程，SRP依赖的共翻译蛋白靶向膜，核糖体RNA加工，病毒转录，平移起始，淀粉样前体蛋白生物合成过程的监管，气管腺体发育，翻译，基因表达，B细胞增殖，详见表2。 　　前10个下调基因涉及嗜中性粒细胞脱颗粒，消化丝氨酸磷酸化，RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控，细胞内信号转导，脂肪垫的开发，GTPase活性的正调控，受体活性的正调控，细胞对缺氧的反应，毛囊成熟，细胞脂代谢过程，详见表3。 　　?疗效相关