水稻多基因敲除系统(1).pdfVIP

水稻多基因敲除系统 Designed by 王春/ 沈兰/ 胡熙璕 中国水稻研究所 王克剑实验室 0571 wangkejian@ 一、原理： 利用Cas9 蛋白在多个gRNA 引导下对基因组多个特异区段产生双链断裂的 特性，创制水稻基因组定点突变体 （见图1）。 二、系统特点： 快捷：编辑4 个以内位点，可以进行载体的快速构建。 高效：一次转化，高频率创制多突变体。 无限：理论上可以同时编辑无限个基因。 图1：CRISPR-Cas9 system 三、质粒 （2 个，见图2 ）： pC1300-UBI:Cas9 （最终载体，细菌中为卡那抗性，植物中为潮霉素抗性， UBI 启动子表达Cas9 蛋白）； SKm-gRNA （中间载体，细菌中为氨苄抗性，转录gRNA，gRNA 序列为优 化版）； 注：下文中提到的pC1300-Cas9 等同于pC1300-UBI:Cas9，SK-gRNA 等同 于SKm-gRNA 。 四、步骤: 1. 靶序列选择及引物设计 2. 单个中间载体构建 3. 多个中间载体聚合 4. 构建至最终载体 5. 转农杆菌转化 1 具体步骤 （简洁版） 1．靶序列选择及引物设计： ↓ A. 在目标基因的基因组序列上找NNNNNNNNNNNNNNNN NNNNGG 序 列为目标序列（绿色表示靶序列，黄色表示PAM 序列, Cas9 的PAM 为NGG ，VQR 的PAM 为NGA, VRER 的PAM 为NGCG ，↓表示CAS9 蛋白拟切割突变位点，在PAM 的前3 个碱 基处）。 Notes: 1）注意是基因组序列，而不是mRNA 序列（↓切割处应设计在外显子上）； 2 ）DNA 正反链都可被选为靶标序列，即反向互补序列也可以用来设计； 3) 靶序列（绿色部分）长度18-20bp 均可，一般设为19bp ；GC 含量越高成功率越高， 一般建议在35%-75%之间，避免“TTTT ”序列。 4 ）设计序列尽可能特异，避免敲除同源序列； 5）靶序列应尽量避免包含后续构建克隆需要用到的酶切序列。如果使用这些酶切位点， 后期克隆时需要注意错开使用相关的酶。 6）靶位点尽量避免产生典型的二级结构 7）example 序列: gaagcaattcgtaggaattcagg B. 设计两个互补DNA 序列分别为：在正向靶序列前加GGCA,在反向互补 靶序列前加AAAC 。（如下：） g++ （F 向） : 5’ GGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG 3’ g -- （R 向） : 3’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA 5’ 18-20 bp Notes: 1）可同时设计检测靶位点的引物。在敲除前检测基因组是否包含该靶标序列，在敲除 后检测靶序列是否发生突变。设计PCR 产物长度500-1000 bp，靶标序列离前段引物200-500 bp 合适，便于测序分析。 2 ）example 的序列设计为：g++ ：ggcagaagcaattcgtaggaattc g-- ：aaacgaattcctacgaattgcttc 2 ．单个中间载体构建： A. SK-gRNA 进行Aar I 酶切(Ferment 公司) ，形成带有粘性末端的载体； B. g++与g--引物混合后变性退火，形成带有粘性末端的片段；