果酒酵母的分离、纯化及选育(实验报告).docx

教育资料 教育资料 一、引言 酿酒酵母细胞透明，呈圆形或椭圆形，形体比较大，一般为 7X12卩m含有 转化酶能将葡萄汁中的糖转化成乙醇、 二氧化碳和其它代谢产物。优良纯种酵母 应具备下列性能：（1）除酿酒水果本身的果香外，酵母也应产生良好的果香与酒 香。（2）生长速度快，有较高的发酵能力，能将糖分全部发酵完。 （3）具有较高 的抗S02能力，有较好的凝集力和较快的沉降速度。（4）培养基成分简单，来源 广泛，价格低廉，对温度，pH,离子强度，溶氧等环境因素不敏感。（5）能在低 温或果酒适宜温度下发酵，以保持果香和新鲜清爽的口味。 由此可见，酵母的品质对果酒的产量和质量影响很大。要获得优良的酿酒 酵母，必须对其进行分离选育。果酒酵母的筛选应从相应的果品及其种植环境中 采样分离，如成熟果实的表皮、自然腐烂发酵的果肉或果汁和果园的土壤等相关 场所。根据实践经验，在果汁和自然发酵的果酒醪液中检出率较高， 因为它们的 基质环境与酿酒环境很相似。为使我们需要的酵母易于检出，应对采集的样品进 行富集培养，通过设置较高的酒精浓度、添加 SO、调整pH等手段抑制不需要 的微生物的生长，使希望检出的微生物得到增殖 。酵母检出后，应对其的发酵 性能进行考察，包括酵母的一系列生理生化特性和风味物质形成的能力等， 这些 可通过作生理生化实验和三角瓶小型发酵实验分析和测定。 二、实验仪器与材料 样品：新鲜苹果（未经清洗）榨汁。 YEPD培养基（富集培养基）：蛋白胨20g，葡萄糖20g，酵母膏10g，蒸馏 水定容至1000ml.（每次根据需要量按如此比例配置，下同） PDA培养基（酿酒酵母培养基）：马铃薯200g，葡萄糖20g,琼脂20g，蒸 馏水定容至1000ml.（马铃薯去皮，切成块煮沸后再煮 30分钟，然后用纱布过 滤，再加糖及琼脂溶化后定容至 1000 ml。121C灭菌30分钟。） PYG培养基（菌种保藏培养基）：蛋白胨3.5g，葡萄糖15g，酵母膏1.5g， KHPO2.0 g，MgSO 7HD1.0 g，（NH） 2SO1.0 g，琼脂 20g，蒸馏水定容至 1000ml. 试剂：亚硫酸钠、乙醇，碘液，无菌生理盐水等。 器具：三角烧瓶（250 mL）、无菌试管、无菌吸管（1 mL及5 mL）、无菌滴管、 接种环、冰箱、酒精喷灯、冰箱、玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，磁力搅拌 器，台式离心机，震荡混合器等。 三、实验方法与步骤 酵母菌在自然界中存在的范围非常广泛，可以从不同的陆地或海洋生物环境 中分离得到。在成熟水果的果皮、果梗上存在的酵母种类十分丰富， 可针对不同 水果原料分离出适合其自身特点的酿酒用酵母菌。 ?酵母菌的分离初筛 1）菌种采样 土壤 样品瓜根际土藤下方土垄间隙土叶片 果实（带柄）腐果 壤 壤 壤 用 无 菌 用无菌剪刀 剪 刀 剪 用无菌 摘取不同龄 取 不 同 剪刀摘 用无菌小铲清去表层石块露出土壤 期的甜瓜（幼 生 长 阶 取腐烂 后，戴好无困手套取500g左右的土 龄期，膨大 段 的 叶 的果实 样装入无菌袋内。 期，成熟期） 片 装 入 装入无 分别装入无 无 菌 袋 菌袋内。 菌袋内。 采集 方法 内。 随机选择三块样地采样，每样采三份，将采集到的样品迅速保存在低温箱 内（冰块降温）。 2）富集培养与纯种分离 方法：配制YEPD培养基分装于100ml三角瓶内每瓶50ml高温灭菌冷却，然 后分别取适量样品（土样1g，果皮5g，果柄若干，叶片若干）各三份接种， 120r/min ,28C摇床培养4天。将富集培养液用接种环划线接种在 PDA培养基上， 每个样品接三个平板，28 E恒温培养。待菌种长出小菌落，镜检为酵母菌后，将 其挑取于PDA平板划线并标号后28E恒温培养。待再次长出单菌落后，挑取划 线于PDA培养基上，28C恒温培养。菌种划线三到四次后基本纯化。 ?酵母菌种的复筛 以无琼脂PDA培养液作为复筛培养基。将初选菌种接入保藏培养基。培养24 h 后每支斜面接入三角瓶培养，置于23-25 C的培养箱中培养，测定其发酵水平及 产香水平，选育出优良健壮、耐性强的适合果酒发酵的酵母菌种。 发酵力试验：采用CO失重法，取100 mL三角瓶（已经烘干、称重），各加入 80 m无琼脂PDA培养液，置于80C的水浴杀菌5min,冷却到30C后，按每升接种 30 mL的比例分别接入酵母种子液，在20 C下发酵。发酵过程中每24h测定1次 CO损失量，每次测定时，摇晃瓶子，以排出CQ随着发酵时间的延续，瓶重逐 渐减轻，直到减轻量不高于0.2 g，即表示发酵结束，以C◎失重量为纵坐标， 发酵时间为横坐标，绘制发酵力曲线，并确定菌株发酵力的强弱。 ?酵母菌的耐受性试验 采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇 （4% 6% 8% ）、二氧