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【代码M0504】免疫复合物的纯化 2015-10-10实验管家 实验管家 实验概要 本实验介绍了免疫复合物纯化的基本操作步骤。  实验步骤 1．准备工作 蛋白A或蛋白G微珠混悬液可在用前准备，4℃保存于含叠氮钠的溶液中。 2．操作步骤 1)?将小量裂解物样本分别置于适当数量的1.5mlEP管中，加入裂解缓冲液，至终体积接近0.5 mol。加入抗血清(1ul)、杂交瘤细胞培养上清液(50ul)或小鼠腹水(0.5ul)作为抗体的起始用量。滴定时抗血清用0.5-5ul，杂交瘤细胞培养上清液用10～100ul，腹水用0.1～1.0ul。 2)?冰上孵育1h。高亲和力的结合反应在1h内完成。因而，1h的孵育时间可使大部分的抗体完成反应。 3)?在抗体-抗原反应液中加入100ul蛋白A或蛋白G微球(用裂解缓冲液配制成10％混悬液)，4℃摇动孵育1h。 尽管有些操作手册建议反应过夜，但实际上并无好处，还会增加背景，因此不主张反应过夜，除某些特殊情况外。 在每一步操作的最后，尽可能完全去除洗涤缓冲液，有利于降低背景。建议在真空泵吸气管末端使用23号针，或用微量加样枪头以减慢流速，控制微球，如果枪头很小可直接插入微球中去除洗涤缓冲液。若微球黏附针孔，在管壁上轻弹即可去除。 4)?以10000g，4℃离心15s，收集微球。用裂解缓冲液清洗免疫复合物3次。裂解产物和洗涤缓冲液很容易通过抽吸法除去