pulldown实验方法总结计划.docxVIP

Pull Down 实验流程 混合两种预测相互作用的蛋白。 （Protein-A-GST Protein-B-HIS，下面实验用 GST 树脂 IP， 用 Western Blot 检测 HIS；反之亦然。如果是纯化后的蛋白，需要进行偷袭或者使用超滤离 心管为蛋白更换溶液，之后才能继续 Pull Down。） 2. 加入 1 mL Binding Buffer 。 Binding Buffer ： 50 mM Tris.HCl （ pH7.50.） 100 mM NaCl 0.25% Triton-X 100 35 mM β -Me（巯基乙醇） 将混合蛋白在 4℃条件下旋转结合 2-4 h。 4. TM 加入 20-30 μ L GST-Bind Resin 结合 2-4 h。 5. 4 ℃， 150-200 g 离心 2 min ，吸弃上清（小心！不要吸弃底部沉淀）。第一次弃去的上 清样品记为 Washing- Protein-A/ Protein-B ，用于 SDS电泳时的对照。 6. 加入 1 mL Binding Buffer ， 4 ℃条件下旋转混匀 5-10 min ， 4 ℃， 150-200 g 离心 2 min ， 吸弃上清。 7. 重复步骤 6，用 1 mL Binding Buffer 清洗 5-6 次。 8. 最后一次清洗后