Folin酚试剂法测定蛋白质含量.doc

. . . . Folin-酚试剂法测定蛋白质含量 一、实验目的 1，掌握 Folin- 酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其具体实验操作技术； 2，掌握制作标准曲线的要领； 3，学会通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。 二、实验原理 1，蛋白质分子中含有的肽键在碱性条件下可以与 Cu2+ 螯合形成蛋白质 - Cu2+复合物，即发生双缩脲反应。 而此复合物中的含酚羟基的酪氨酸或色氨酸残基可以还原 Folin- 酚试剂的磷钼酸盐 - 磷钨酸盐，产生蓝色化合物（钼蓝和钨蓝的混合物），即发生 Folin- 酚显色反应。同时，在碱性条件下 Folin- 酚试剂极不稳定，从而易被蛋白质还原而呈蓝色反应。 ，在一定浓度范围内， 蓝色化合物的蓝色深浅与蛋白质浓度呈正比。 故通 过测定相应浓度梯度的蛋白质标准溶液吸光度可依其作出标准曲线， 以此绘制的 标准曲线和供试品中蛋白质溶液吸光度可求出供试品中蛋白质的含量。 三、材料和方法 样品：健康人血清（ 300 倍稀释）；正常人血清蛋白质含量： 60~80 g/L 试剂：牛血清白蛋白标准液（ 200μg/ml ）；碱性硫酸铜溶液（现配）； Folin-酚试剂 仪器与器材： V-1100 分光光度计； 恒温水浴箱； 试管 6 支、试管架； 加样枪、加样枪架； 坐标纸 参考资料 . . . . 实验步骤示意 蛋白 40℃ 标 准液 混合均匀 加酚 2s 内混 冷却 水浴 比色 静置 10min 试剂 合均匀 至室温 碱性硫 10min 酸铜溶液 详细步骤 A，配置一定浓度梯度溶液 : 取 6 支试管分别编号 1 至 6，按下表加样。（1 作空 白对照， 2-5 作标准， 6 为待测样品） 1，加样时按横向顺序加样，并在加入碱性硫酸铜时：于一号试管加入碱性硫酸 铜溶液 2ml 后等待一分钟再往下一支试管加入同量的碱性硫酸铜溶液， 摇匀。如 此类推混匀并将其静置在室温下。 2，在全部试管加完碱性硫酸铜试剂之至距第一支试管加样 10 分钟后，于第 1 支试管立即加入 0.20mL Folin- 酚试剂，并于 2s 内摇匀。 1 分钟后第 2 支试管加入 0.20mL Folin- 酚试剂， 2 分钟后加第 3 支试管，以此类推。 试剂（ ml ） 空白管 标准管 样品管 1 2 3 4 5 6 牛血清蛋白标准液 - 0.20 0.40 0.60 0.80 - 样品液（稀释 300 倍） - - - - - 0.50 蒸馏水 1.0 0.80 0.60 0.40 0.20 0.50 碱性硫酸铜 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 Folin- 酚试剂 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 蛋白质浓度（ μg/ml） 0 40 80 120 160 未知 B，加样完毕后将各试管每隔 1min 按 1-6 顺序放一只试管入水浴箱，分别 40℃ 水浴 10min 后取出冷却至室温。 参考资料 . . . . C，以 500nm 波长比色，以 1 号管作空白对照，按 2-6 顺序每隔一分钟测定一支试管内溶液吸光度并重复测三次， 记下读数，求出平均值，记录数据并计算结果。 四、结果与讨论： 结果： A，实验过程现象： 1，在向试管中加入 2ml 碱性硫酸铜溶液并摇匀后，溶液澄清，无明显现象； 2，在向试管中加入 0.20mL Folin- 酚试剂并立即摇匀时观察到：溶液由浅绿立 即先变黄后变浅蓝，且蓝色随时间延长而有所加深。 B，吸光度数据： 500nm 波长吸收度值记录 各管吸光度值 A 500 测定次数 2 3 4 5 6 1 0.063 0.119 0.173 0.222 0.148 2 0.059 0.119 0.171 0.219 0.150 3 0.064 0.118 0.175 0.212 0.140 — 0.0620 0.1187 0.1730 0.2177 0.146 各管平均值 A500 （对照组的实验数据均为 0） 根据 吸光度数据绘制图表： 试管 1 2 3 4 5 6 牛血清蛋白标准液浓 0 40 80 120 160 - 度（ μg/ml） A 500 平均值 0 0.0620 0.1187 0.1730 0.2177 0.146 参考资料 . . . . 将测得样品管吸光度 0.1460 代入标准曲线公式 y=0.0013x+0.0125 中，得出样品 浓度为 102.7 μg/ml 。 即： C（未稀释蛋白含量 ） = C（ 稀释后蛋白质含量 ） ×2×300 102.7 μg/ml ×600 61.62 μg/ml 61.62g/L 正常人血清蛋白浓度参考范围为： 60~80g/L 以上依赖所得实验数据分析得出的待测蛋白浓度落