荧光分光光度法测定维生素B2的含量..docVIP

荧光分光光度法测定维生素 B2 的含量 实验报告 ——应用化学（环境检测与分析） 一、实验目的 1、掌握标准曲线法定量分析维生素 B2 的基本原理。 2、了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，掌握其基本操作。 二、实验原理 什么是荧光？ 荧光是光致发光。当物质的分子接受光子能量被激发后，从激发单重态的最低振动能级返回 基态时发射的光。 2 荧光与环境因素的关系 取代基的性质、溶剂的极性、体系的pH 和温度。 维生素 B2(Vitamin B2) ，别名：核黄素 (Riboflavin ， RF)，是橘黄色无臭的针状结晶 , 分子式： C17H20N4O6 ，相对分子量为： 376.37 。因其色黄且含有核糖醇，故称为核黄素。结构式为： 1 由于分子中有三个芳香环，具有平面刚性结构，因此它能够发射荧光。维生素 2 B 易溶于水而不 溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。 维生素 B2 溶液在 430— 440nm 蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在 535nm 附近。维生素 B2 在 pH＝6— 7 的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素 B2 溶液浓度呈线性关系，因此可以 用荧光光谱法测维生素 B2 的含量。维生素 B2 在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物 质——光黄素，光黄素也是一个能发荧光的物质，其荧光比维生素 B2 的荧光强得多，故测维生素 B2 的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。 在稀溶液中，荧光强度 F 与物质的浓度 c 有以下关系： F＝ 2.303 Ф I 0ε bc 当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系： F=Kc 这是荧光光语法定量分析的依据。 三、仪器与试剂 1、主要仪器：荧光分光光度计（日立 F— 7000 ）；比色皿： 1cm；容量瓶： 50mL；移液管： 5mL。 2、试剂：核黄素；维生素 B2 药片 四、实验步骤 溶液的配制 标准溶液的配制：精确称取 2 mg 核黄素 (VB2) ，用超纯水于 50ml 棕色容量瓶中定容 待测液的配制： 将维生素 B2 药片研磨成粉末状， 精确称取 2mg，用超纯水于 50ml 棕色容量瓶中定容； 扫描激发光谱和荧光光谱 标准曲线的绘制 在室温条件下，分别吸取 1.0 、2.0 、 3.0 、 4.0 、5.0 标准溶液于 50ml 棕色容量瓶中定容。用超纯 水作空白试样，测定溶液荧光强度值。用所测结果绘制荧光强度 (F) 对浓度 (c) 的曲线。 待测液 VB2 含量的测定及数据处理 2 五、实验结果及数据处理 ex ＝442nm 3 em＝524nm VB2标准曲线及药片中 VB2含量的测定（大浓度） 4 VB2标准曲线及药片中 VB2含量的测定（稀释到中间浓度） 六、总结、讨论 1、实验注意事项： 1）配制标准溶液时，为了减少仪器偏差，取不同体积的同种溶液应用同一移液管。 2）因荧光是从石英池下部通过，所以拿取石英池时，应用手指捏住池体的上部，不能接触下部。清洗样品池后，应先用吸水纸吸干四个面的液滴，再用擦镜纸往同一方向进行轻轻擦拭。 3）在使用荧光分光光度计时，须按照既定程序进行。在测定系列标准溶液的浓度和荧光强度时，必须按顺序放入测定。 4）在测试样品时，应注意样品的浓度不能太高，否则由于存在荧光猝灭效应，样品浓度与荧光强度不呈线性关系，造成定量工作出现误差。 2、此次实验，影响标准曲线的线性的主要因素是配制溶液时，操作是否规范、标准。 七、思考题 1、试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因？ 答：由于现代电子技术具有检测十分微弱光信号的能力，并且荧光强度与激发光强度成正比， 提高激发光强度也可以增大荧光强度，使测定的灵敏度提高；而吸收光度法测定的是吸光度，不管 是增大入射光强度， 还是提高检测器的灵敏度， 都会使透射光信号与入射光信号以同样的比例增大， 5 吸光度值不会改变，因此灵敏度不能提高。 2、维生素 B2 在 pH=6~7 时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？ 答：因为维生素 B2 在碱性溶液中经光线照射，会发生分解而转化为光黄素，后者的荧光比维生 素 B2 的荧光强的多。因此，测量时溶液要控制在酸性范围内进行。 6