酶的分离纯化及产品成型.ppt

电泳的定义 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳(electrophoresis，简称EP)。 电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的一类实验技术。 电泳发展:电泳现象早在1808年就已经被发现，但电泳作为一种分离技术却是在1937年由瑞典科学家Tiselius A首先提出来的，并设计出世界上第一台自由电泳仪，建立了“移界电泳”分离模式。他用光学方法观察到在电泳迁移过程中血清蛋白质界面的移动，首先证明了血清是由白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白组成的，为表彰他对电泳技术所做出的突出贡献，1948年他被授予诺贝尔奖。 带电粒子在电场中迁移的速度： A、α—常数 r—粒子的半径 Q—粒子的表面电荷量 η—介质的粘度 E—电场强度 μ—介质的离子强度 一、 电泳的基本原理 此式表明：影响电泳时带电粒子迁移速度的因素，包括： （1）电场强度（电压） （2）带电粒子表面电荷 （3）带电粒子大小 （4）介质的粘度 （5）溶液的离子强度 （6）电渗的影响，公式中没有反映，主要在纸电泳时表现较明显。 在一定的电泳条件下，E（V）、η、μ为定值，对于酶等两性大分子来说，电泳时的迁移速度，主要取决于分子的表面电荷多少和分子大小，因此，不同的分子可以由Q和r不同而彼此分离。 蛋白质（酶）的电荷性质和电荷量，取决于它们的PI与溶液的pH值的关系。 1、聚丙烯酰胺凝胶（PAG） PAG由丙烯酰胺（ arc，单体）和甲叉双丙烯酰胺（ bis，双体，交联剂）在催化剂作用下聚合而成。 arc浓度：凝胶的孔径大小 arc和bis的比例：凝胶的强度 催化剂用量：聚合时间 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 2、PAGE的应用类型 常规PAGE 浓度梯度PAGE SDS不连续PAGE（用于一般分析分离纯化） 连续PAGE（同上） （用于测定Pr相对分子质量和分离纯化） （用于测定Pr单体相对分子质量和双向电泳） 3、不连续PAGE的特性和分离Pr的效应 （1）三个不连续 凝胶浓度不连续； pH值不连续； 缓冲液不连续。 （2）三种效应 浓缩效应； 电荷效应； 分子筛效应。 4、浓度梯度PAGE 配制4%和30%的分离胶，在梯度混合仪制成从上至下4%~30%的均匀浓度梯度凝胶，其网眼孔径从上至下越来越小，电泳时，不同Pr主要依 r 大小而分离，即分子筛效应>电荷效应,可用于测定蛋白质的相对分子质量。 5、SDSSDS：十二烷基硫酸钠 CH3（CH2）11SO4Na2 在配制凝胶时加入SDS，同时加巯基乙醇，Pr在电泳时，其中的寡聚体Pr解聚为单体（亚基），SDS分子就将每个单体分子表面覆盖起来，使其形成短轴为1.8nm，而长轴各异的SDS—亚基复合物，电泳时，他们的表面电荷基本相同，故可因分子长轴大小（即亚基分子大小）差别而分离，换言之，亚基的大小是彼此分离的依据，所以此法可用于测定单体的相对分子质量。 6、PAGE的一般操作程序 配制各种制胶的贮存液 准备制胶模具 配制铸胶混合液 灌注胶液并聚合成凝胶 上槽 点样 通电电泳 取出凝胶 Pr染色 漂洗显带 记录计算 绘制电泳图谱 SDS测定蛋白质（亚基）的相对分子质量（Mr）与它们的电泳迁移率（U）之间，存在如下关系： lgMr = lgK - bU 用 lgMr 对 U 作图，只要实验测得，就可用标准曲线法求得未知蛋白质（亚基）的相对分子质量。 实际工作中，常用相对迁移率（用 mR 表示）代替 U 作图。 mR = 蛋白质移动的距离 溴酚蓝移动的距离 三、等电点聚焦电泳（IEFisoelectric focusing ） 1、等电点聚焦电泳分离Pr原理 等电点聚焦电泳是在电泳介质中加入两性离子载体，电泳时形成由阳极到阴极的连续递增的pH梯度，蛋白质按其电荷性质不同各自向着与其等电点相等的pH处移动聚焦，从而彼此分离的电泳技术，无论Pr从正极出发或是从负极出发，都会聚焦在等电点处。 2、两性离子载体 各组分的pI值十分接近，在电泳中可以形成连续的pH梯度，常用的商品名为Ampholine，规格有pH3.5~9.0和精细分级的pH3.5~5、5~9、9~11的多种商品可供不同的要求使用。 第五节 酶液的浓缩、结晶、干燥与成型 一、稀酶液的浓缩 浓缩是从稀溶液中除去一部分溶剂（水），使其变成浓缩液的工艺。