发酵综合项目工程制药实验链霉菌发酵.doc

试验2灰色链霉菌活化 一、试验目标 一、试验目标 学习制备高氏一号斜面培养基方法和斜面接种技术。 二、试验原理 二、试验原理 高氏一号斜面培养基是一个合成培养基，用于培养放线菌。 三、试验试剂和仪器 三、试验试剂和仪器 1. 菌种：灰色链霉菌； 2. 培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1 g，氯化钠0.5 g，磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，琼脂20 g，水1000毫升，PH7.2—7.4（配制时注意，可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中）； 3. 器材：天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、18mL×180mL试管、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。 四、试验步骤 四、试验步骤 1. 高氏一号培养基制备 （1）按配方称量药品，加热搅拌至琼脂完全熔化，补水至1000mL。趁热分装于18mL×180mL试管，斜面以8mL为宜。 （3）分装完成后，塞好棉塞并将试管捆扎好。高压蒸汽灭菌：121℃灭菌20min，灭菌后趁热摆斜面。 2. 斜面接种 接种是将纯种微生物，在无菌操作条件下，移植到已灭菌并适宜该菌生长繁殖所需要培养基中。为了取得微生物纯种培养，要求接种过程中必需严格进行无菌操作。通常是在无菌室内，超净工作台或试验台酒精灯火焰旁进行。 （1）左手拿试管菌种，右手拿接种环，先将金属环烧灼灭菌，再将接种环在空白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻。 （2）左手将试管菌种放下，拿起斜面培养基。在火焰旁用右手小指和手掌边缘拔下棉塞并夹紧，快速将接种环伸入空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。划线时由底部向上划一直线，一直划到斜面顶部。注意勿将培养基划破，不要使菌体沾污管壁。 （3）灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞上。接种完成，接种环上余菌必需灼烧灭菌后才能放下。 （4）斜面置于28℃恒温箱中，培养5～6d观察结果。 试验3 灰色链霉菌摇瓶种子制备 一、试验目标 一、试验目标 学习制备摇瓶种子培养基方法和种子扩大培养技术。 二、试验原理 二、试验原理 种子扩大培养简称种子扩培，是 发酵工程一个组成部分，其指将保留在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及 种子罐逐层扩大培养,最终取得一定数量和质量纯种过程。其目标首先是出于接种量需要和菌种驯化，同时对于缩短发酵时间、确保生产水平也有帮助。 种子扩培通常过程是： 　　 斜面菌种 → 一级种子培养（摇瓶） → 二级种子培养(种子罐) → 发酵 　　对于种子制备过程，其大致可区分为 试验室阶段和生产 车间阶段，前期不用种子罐，所用设备为培养箱、摇床等试验室常见设备，在工厂这些培养过程通常全部在菌种室完成，所以将这一培养过程称为试验室阶段种子培养。以后期种子培养在种子罐里面进行，通常在工程上归为发酵车间管理，所以形象地称这些培养过程为生产车间阶段。并非全部种子扩大培养全部采取从摇瓶到种子罐二级发酵模式，其实际发酵级数受到发酵规模、菌体生长特征、接种量影响。 摇瓶培养技术问世于本世纪30年代，因为其简便、实用，广泛用于微生物菌种筛选、试验室大规模发酵试验、种子培养等。摇瓶培养设备关键有旋转式摇床和往复式摇床两种类型，其中以旋转式最为常见。振荡培养中所使用发酵容器通常为三角烧瓶，也有使用特殊类型烧瓶或试管。振荡培养技术通常见于微生物菌种筛选或生产工艺改良和工艺参数优化。 在摇瓶培养过程中振荡目标在于改善活细胞氧气和营养物供给。摇瓶培养通常以特定生长条件下培养物接种，也可用孢子接种。振荡培养是建立深层发酵开始，就一特定微生物而言，振荡培养时存在一最好培养基配方和最好培养基容量。细胞或孢子接种浓度对试验成功极为关键，不一样微生物细胞或孢子和不一样振荡培养过程接种浓度差异可能是十分显著，且各自存在一最适浓度。 三、试验试剂和仪器 三、试验试剂和仪器 1. 菌种：灰色链霉菌（由试验二活化得到）； 2. 培养基：豆饼粉20g、淀粉40g、酵母膏5g、蛋白胨5g，硫酸铵3g，硫酸镁0.25g，磷酸二氢钾0.2g，碳酸钙4g，自来水1000mL、pH7.2 3. 器材：天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、250mL三角瓶、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。 四、试验步骤 四、试验步骤 1. 摇瓶种子培养基制备 取洁净三角烧瓶，250ml三角瓶分装培养基30-50ml，用棉塞包扎瓶口，再加牛皮纸包扎，在0.1MPa下灭菌45-60min。 2. 接种 将活化菌种斜面，在无菌条件下，注入10mL无菌水，震荡成孢子悬浮液（孢子浓度约为8×104个/mL）。待发酵培养基灭菌后冷却到28℃ 3. 培养和观察 28℃、200r/min旋转式摇床培养 试验4