Sequenom_SNP实验过程说明.pdfVIP

博奥生物有限公司 生物芯片北京国家工程研究中心 生命科学服务部 Sequenom SNP 实验过程说明文件 目录 一、实验基本流程及原理 1 二、实验过程2 1、引物设计 2 2、DNA 提取 3 3、PCR 扩增3 4、PCR 产物碱性磷酸酶处理3 5、单碱基延伸 4 6、树脂纯化 5 7、芯片点样 5 8、质谱检测 5 三、附录 实验所需的试剂、耗材和仪器设备 5 一、实验基本流程及原理 Sequenom MassARRAY®SNP 检测过程结合多重 PCR 技术、MassARRAY iPLEX 单碱基 延伸技术，和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术（matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight ，MALDI-TOF ）进行分型检测。将包含 SNP 位点 区域的 DNA 模板通过 PCR 技术扩增，再使用特异的延伸引物与 PCR 产物进行单碱基延伸 反应。由于多态性位点碱基不同，延伸产物不同的末端碱基将导致延伸后的产物分子量的差 异，因此由 SNP 多态性引起的碱基差异通过分子量的差异而体现，通过基质辅助激光解吸 附电离飞行时间质谱分析质谱技术，检测延伸产物分子量的大小，应用专用的分析软件，通 过判断分子量的差异而进行 SNP 分型检测。SNP 检测实验基本步骤如下图所示： 1 博奥生物有限公司 生物芯片北京国家工程研究中心 生命科学服务部 图 1 Sequenom MassARRAY® SNP 检测实验基本步骤 二、实验过程 1、 引物设计 使用 Sequenom 公司 Genotyping Tools 及 MassARRAY Assay Design 软件设计待测 SNP 位点的 PCR 扩增引物及单碱基延伸引物 ，并交由生物公司合成。 2 博奥生物有限公司 生物芯片北京国家工程研究中心 生命科学服务部 2、 DNA 提取 使用 Wizard Genomic DNA purification Kit (Promega)或 NucleoSpin Tissue (MN)等试 剂盒或类似产品，提取组织、细胞或血样中的 DNA。用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳 质检 ，基因组DNA 电泳条带通常不小于 20kb。质检合格的 DNA 将浓度调整到 50ng/µl ， 转移至 384 孔板，-20℃储存备用。 3、 PCR 扩增 PCR 扩增采用多重 PCR 技术, 在 384 孔板中进行，每个反应体系总体积为 5µl。 （1 ） 在一个新的 1.5ml EP 管中配制 PCR master mix 溶液。 配制 PCR master mix 液： PCR Mix 对每个反应，µL 10×PCR Buffer 0.5 MgCl2 (25mM) 0.4 dNTP mix (25 mM ) 0.1 HotStar Taq (5U/µL) 0.1 Water 1.9 PCR primer mix 1